新疆白芸豆中凝集素的提取及纯化工艺.docx

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新疆白芸豆中凝集素的提取及纯化工艺

新疆白芸豆中凝集素的提取及纯化工艺

凝集素（lectin）是一类至少有1个非催化结构域、能非共价地可逆结合专一性单糖或寡糖的非免疫源性、非酶本质的糖结合蛋白，目前在动物、植物、微生物和病毒中均有發现[1-3]。

关于凝集素的免疫作用、抗营养作用（致毒作用）、使细胞表面成分再分布、修饰细胞膜酶的活力、阻断卵受精、对脂肪细胞具有类似胰岛素的活性等也逐渐被研究和证实[4-5]。

目前对于凝集素的研究主要集中于植物凝集素，由于凝集素对于单糖或糖复合物特异性结合的能力，使其在如信号转导、免疫反应、植物防御等诸多信号过程中均具有重要作用。

同时，凝集素具有细胞凝集、抗病毒、抗真菌及诱导细胞凋亡或自噬等多种能力，因此在生命科学、医学及农业方面均有较好的研究价值和应用前景。

在植物凝集素研究中发现，豆科植物凝集素种类最丰富，有600多种，其中70多种已经被分离纯化，大多来自豆科植物的种子，在成熟种子中占蛋白质总含量的10%左右。

另外，在其他组织，如叶、茎、果实、树皮、根中也分布着一些与种子凝集素高度同源的凝集素[7-9]，它们虽然与种子凝集素有类似的氨基酸序列和糖结合特异性，但仍然是由不同基因编码的。

豆科植物凝集素一级氨基酸序列和三级结构相似性很高，但是糖专一性和四级结构却有很大的不同。

因此，研究不同豆科类来源凝集素的结构，对于豆科类凝集素在生物学、农学和医学领域的应用具有重要的意义。

白芸豆（whitekidneybean）属豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papiliononideae）菜豆族菜豆属。

由于其营养价值丰富（100g干豆中含碳水化合物37.6%～48.5%，蛋白质19.9%～20.0%，脂肪1.6%～2.1%，钙120mg，铁10mg），因此可作为一种高钾低钠食品，适合高血脂、心脏病、动脉硬化和忌盐者食用，而且食用后不会产生腹泻、乏力、厌食、体质量反弹等现象，完全符合世界卫生组织的减肥原则[13-16]。

因此，自白芸豆从阿根廷、墨西哥引进并经人工栽培驯化后已经在全国各地广泛种植。

然而，目前关于白芸豆中凝集素的研究却鲜有报道。

因些，本研究以新疆白芸豆为研究对象，通过响应面分析法优化凝集素的提取工艺，并通过实际试验考察以验证响应面模型的正确性。

利用二乙氨乙基（DEAE）A-50阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶层析对凝集素的粗提取物进行纯化，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，确定目标凝集素的分子量，以期为后续研究其结构及生理功能打下基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

主要材料：

白芸豆，购自新疆石河子市好家乡超市。

主要试剂：

牛血清蛋白（分析纯），天津市致远化学试剂有限公司；磷酸二氢钠（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯），天津市福晨化学试剂厂；氯化钠（分析纯）、分析纯乙醇（95%），天津市永晟精细化工有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris，分析纯），北京拜尔迪生物科技有限公司；考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）G-250（分析纯），Biotopped。

1.2仪器与设备

主要仪器与设备：

PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；BINDER电热恒温鼓风干燥箱，北京航鹏普瑞技术开发中心；HeraeusMultifugeX3电动离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；RHP-600高速粉碎机，浙江荣浩工贸有限公司；KQ-200VDE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度计，岛津（中国）有限公司；JM-B*****电子天平，诸暨市超泽衡器设备有限公司。

1.3试验方法

1.3.1原料预处理将市场上购买的白芸豆去除杂质，准确称取30g，在4℃冰箱中用150mL蒸馏水浸泡24h，捞去杂质并沥干后，手工去皮，在35℃烘箱中干燥后经粉碎机粉碎，过80目筛得到白芸豆种子粉末。

将经过上述处理的样品装入聚乙烯袋中，4℃冰箱中保藏备用。

1.3.2蛋白质浓度的测定对蛋白质含量的测定采取的是考马斯亮蓝G-250法。

参考王孝平等的方法，略有改动。

1.3.3白芸豆凝集素活力检测参照李笑梅等的方法[18-19]，略有改动。

利用采血管抽取新鲜鸡血10mL，抽取2mL至肝素钠抗凝管中。

将新鲜血液倒入离心管中并于3000r/min离心3min，用移液枪去除上层血清，向沉淀中添加生理盐水以清洗血红细胞。

轻轻颠倒摇匀洗涤，然后再次于3000r/min离心3min，去除上清液，如此重复操作洗涤3次。

根据红细胞压积，按照离心出的红细胞体积，加入生理盐水配成浓度2%的红细胞悬液，在4℃冰箱中保存备用。

在96孔反应板上，每孔加入50μL生理盐水；在96孔板各排第1孔内分别加入50μL样品溶液，混匀后从第1孔吸取50μL加入第2孔，混匀后再吸取50μL加入第3孔，按此方法倍比稀释到第11孔，混匀后吸取50μL弃去，以第12孔作空白对照；再在每孔内加入50μL红细胞悬液，水平摇动，放置1.5h后观察凝集效果。

凝集素的特异性活力计算方法见式

（1）：

特异性活力（HU/mg）=血凝滴度（2n）×1000μg/mg1每孔添加体积（μL）×凝集素或粗蛋白濃度（μg/μL）。

（1）

式中：

n为样品经过倍比稀释后在96孔“V”形板上的凝集孔数，孔；2n为凝集素的血凝滴度，指在96孔板上使鸡血红细胞凝集的最小稀释倍数。

1.3.4提取条件优化单因素试验

1.3.4.1提取剂的确定准确称取10g豆粉，按料液比1g∶10mL，分别加入0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液（PB，pH值为7.6）、生理盐水、去离子水、Tris-HCl（pH值为7.6），超声波振荡20min后，在4℃冰箱中进行浸提，设定提取时间为18h；浸提液经4层纱布过滤后，将上清液倒入离心管中，于6000r/min离心20min，将得到的上清液分别用96孔“V”形板反应法和考马斯亮蓝G-250法进行血凝检测和蛋白质含量测定，确定最佳提取液。

1.3.4.2提取液pH值的确定准确称取10g豆粉，按料液比1g∶10mL，分别加入0.05mol/LpH值为6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的PB，超声波振荡20min后，在4℃冰箱中进行浸提，设定提取时间为18h；浸提液经4层纱布过滤后，将上清液倒入离心管中，于7000r/min离心20min，将得到的上清液分别利用96孔“V”形板反应法和考马斯亮蓝G-250法进行血凝检测和蛋白质含量测定，确定最佳pH值。

1.3.4.3料液比的确定准确称取10g豆粉，分别按1g∶6mL、1g∶8mL、1g∶10mL、1g∶12mL、1g∶14mL的料液比，加入0.05mol/LPB（pH值=7.6），超声波振荡20min后，在4℃冰箱中进行浸提，设定提取时间为18h；浸提液经4层纱布过滤后，将上清液倒入离心管中，于6000r/min离心20min，将得到的上清液分别利用96孔“V”形板反应法和考马斯亮蓝G-250法进行血凝检测和蛋白质含量测定，确定最佳料液比。

1.3.4.4提取时间的确定准确称取10g豆粉，按照料液比1g∶10mL，加入0.05mol/LPB（pH值=7.6），超声波振荡20min后，在4℃冰箱中进行浸提，分别设定提取时间为16、18、20、22、24h；浸提液经4层纱布过滤后，将上清液倒入离心管中，于8000r/min离心20min，将得到的上清液分别利用96孔“V”形板反应法和考马斯亮蓝G-250法进行血凝检测和蛋白质含量测定，确定最佳提取时间。

1.3.5响应面试验设计在单因素试验基础上，采用Design-Expert7.0软件应用响应面分析法，以料液比（A）、提取时间（B）和pH值（C）为主要影响因素，以特异性活力为（Y）为响应值，设计3因素3水平试验（表1），选用Box-Behnken通过试验数据拟合响应面模型，对单因素试验结果进行响应面试验，研究工艺条件对提取效果的影响。

每个试验组合重复试验3次，取其平均值作为结果，试验结果采用Design-Expert7.0软件分析，确定最佳工艺路线。

1.3.6白芸豆凝集素的硫酸铵分级沉淀法纯化将白芸豆豆粉与提取剂混合，置于4℃冰箱，将溶液进行超声波振荡，抽提24h，用4层纱布过滤，弃去滤渣，滤液于10000r/min离心15min，收集上清液；向上清液中加入固体硫酸铵至40%饱和度，置于4℃冰箱12h，然后于10000r/min离心15min；收集上清液后，逐渐加固体硫酸铵至溶液70%饱和度，4℃静置12h后于10000r/min离心15min，收集沉淀，将沉淀溶于提取剂，透析、冷冻干燥，得到白芸豆凝集素粗提物，置于4℃冰箱中备用。

1.3.7白芸豆凝集素的柱层析纯化

（1）DEAEA-50的预处理。

称取5gA-50，悬于500mL蒸馏水中，1h后倒去上层细粒；再按1gA-50加15mL0.5mol/LNaOH的比例，将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH中，搅匀，静置30min，反复用蒸馏水洗至pH值呈中性；再用0.5mol/LHCl同以上操作过程进行处理；最后用0.5mol/LNaOH再处理1次，放于电热炉上煮沸30min进行脱气处理，处理完后将A-50浸泡于pH值7.5的PB中过夜。

（2）装柱。

将PB缓冲溶液沿玻璃棒倒入柱中约1/4高度，再倒入预处理后与上样缓冲液调成稀糊状的A-50，待A-50凝胶沉降2～3cm厚时，开启出水口螺旋夹，控制流速1mL/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度；关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，塞紧柱上口；平衡：

开启出水口螺旋夹，控制流速12～14d/min，使约2倍体积的洗脱液流出。

（3）SephadexG-75凝胶预处理。

100mL烧杯中称取5gG-75，加入50mL去离子水，浸泡溶胀24h；随后倒去SephadexG-75溶胀后凝胶上层的清水，加入凝胶等体积的1.0mol/LNaOH溶液处理，用搅拌棒轻轻搅动，并浸泡1h后倒去上层液体，再用蒸馏水洗涤，洗涤过程中用倾去法除去细颗粒，其方法是将凝胶搅匀（注意不要过分用力搅拌以防止颗粒破碎）并放置数分钟；将未沉淀的细颗粒随上层的水倒掉，重复3～5次，直至上层没有细颗粒为止，再浸泡于水中至中性；将G-75凝胶水溶液放于电热炉上进行煮沸脱气处理30min。

装柱方法类似DEAEA-50阴离子柱。

平衡后即可正常使用。

1.3.8SDS-PAGE分析方法SDS-PAGE采用Laemmli的方法，不连续垂直板状凝胶电泳。

白芸豆凝集素电泳条件：

浓缩胶5%，分离胶12%。

（1）试剂的配制。

10%SDS：

将10gSDS加水定容至100mL。

10%过硫酸铵：

0.1g过硫酸铵加1.0mL水，混匀，使用前配制。

丙烯酰胺单体贮液：

29.10g丙烯酰胺+0.90gN，N’-甲叉双丙烯酰胺加水定容至100mL，用棕色瓶于4℃保存。

分离胶缓冲贮液（1.5mol/LTris-HCl，pH值8.8）：

将18.15gTris溶于80mL水，用4mol/LHCl调pH值至8.80，定容至100mL，4℃保存。

浓缩胶缓冲贮液（1.0mol/LTris-HCl，pH值6.8）：

将12.10gTris溶于60mL水，用4mol/LHCl调pH值至6.80，定容至100mL，4℃保存。

样品缓冲液：

1%SDS，0.1mol/LTris-HCl，0.01mol/Lβ-巯基乙醇，0.1g/L溴酚蓝，150g/L蔗糖，pH值8.0，4℃保存。

电泳缓冲液：

3.0gTris+14.4g甘氨酸（gly）+1.0gSDS，加水定容至1000mL，4℃保存。

脱色液：

50mL甲醇，75mL冰乙酸，875mL纯水。

染色液：

2.5g考马斯亮蓝R-250，454mL甲醇，92mL冰乙酸，454mL纯水。

（2）操作方法。

每次电泳时，样品和marker须在沸水浴中保持5min，然后在常温下进行电泳。

电泳结束后将凝胶小心放入容器中加入染色液，染色结束后用脱色液在脱色摇床上脱色，其间更换脱色液3～4次直到条带清晰。

凝胶的组分见表2，胶板大小为80mm（W）×73mm（H）×0.75mm（T）。

2结果与分析

2.1提取条件优化单因素试验

2.1.1不同提取剂对白芸豆凝集素特异性活力的影响由图1可见，提取液种类的不同对白芸豆凝集素特异性活力有明显影响，PB组的凝集素特异性活力明显高于Tris-HCl组、生理盐水组、去离子水组，这可能与凝集素是一种水溶性的蛋白质或者糖蛋白有关，蛋白质在具有一定离子强度的浸提剂中的溶解度要高于在去离子水中的溶解度，而Tris-HCl组有更多的杂蛋白溶解出来，对进一步的分离纯化造成负担，导致凝集素含量下降。

因此，确定PB作为提取液。

2.1.2pH值对白芸豆凝集素特异性活力的影响由图2可见，pH值从6.4增加至7.6过程中，随pH值的不断上升，白芸豆凝集素的特异性活力值也逐渐增大，这可能是由于凝集素作为一种蛋白质，是一种两性解离的物质，当提取剂pH值接近凝集素的等电点时，会使凝集素发生沉淀，导致对应的特异性活力值较低；当pH值为7.6时，特异性活力达到最大值，为1179.661HU/mg，说明在此pH值条件下，有利于更多的凝集素溶出。

因此，确定pH值为7.6为最佳提取液pH值。

2.1.3料液比对白芸豆凝集素特异性活力的影响从图3可见，随着料液比的增加，凝集素的特异性活力也发生明显的变化，总体呈先提高后降低趋势；在料液比1g∶10mL时白芸豆凝集素的特异性活力达到峰值，在料液比较低的时候，白芸豆凝集素的特异性活力较低。

究其原因，可能是当料液比较低时，由于提取剂的浓度不够，导致蛋白质不能完全被提取，随着料液比的增加，传质动力增加，蛋白质的提取率也就随之上升，相应的凝集素特异性活力提高。

因此，从原料的成本考虑，选择提取料液比1g∶10mL比较适宜。

2.1.4提取时间对白芸豆凝集素特异性活力的影响从图4可见，随着提取时间的延长，凝集素活力先上升后下降，时间为18h时，达到峰值。

说明利用提取剂提取豆粉中的凝集素时，时间的延长有利于凝集素的溶出；但是，提取时间并不是越长越好，过度的时间延长可能会导致豆粉中的一些酶类将蛋白质分解，同时由于微生物的存在，它们的生长繁殖也会消耗一些蛋白质，而这些损失掉的蛋白质中有可能含有凝集素；此外，时间越长，成本越高，因此选择凝集素活力表现最佳的阶段进行提取。

由此可见，提取时间为18h比较合适。

2.2响应面法优化提取条件

2.2.1响应面曲面试验设计与结果在单因素试验的基础上，以特异性活力（Y）为响应值，根据Design-Expert7.0的中心组合设计原理，设计3因素3水平响应面分析试验，以料液比（A）、提取时间（B）、pH值（C）为主要影响因素，响应面试验设计见表1，结果见表3，对该回归模型及系数进行显著性检验的结果见表4。

运用Design-Expert7.0数据统计分析软件对表3试验结果进行多元回归拟合，得到多元二次回归方程：

Y=411.13+7.19A+41.65B-31.21C-3.69AB-6.65AC-39.71BC-3.45A2-106.41B2-20.67C2。

由表4可看出，模型P值=0.02120.05，该模型是显著的；失拟项P值=0.79160.05，差异不显著；残差均由随机误差引起，表明所建立的回归二次模型成立，此模型可用作预测和分析白芸豆凝集素提取工艺参数。

依据回归系数模型显著性检验可知，在选定的范围内，影响蛋白质提取率的主次因素为BCA，即提取时间pH值料液比；模型的R2=0.868，模型拟合程度很好。

2.2.2响应面分析为进一步研究相关变量之间的交互作用，通过Design-Expert7.0统计软件绘制响应面曲面进行直观分析。

从图5-A中可以看出，料液比对凝集素特异性活力的影响呈现线性关系，而提取时间呈二次影响；随着料液比的不断升高，凝集素特异性活力没有表现明显的变化；而随着提取时间的不断增加，凝集素特异性活力呈现出先增强后减弱的趋势。

从图5-B中可以看出，料液比对凝集素特异性活力的影响呈现线性关系，而pH值呈二次影响；随着料液比的不断升高，凝集素特异性活力没有表现明显的变化；而随着pH值的不断上升，凝集素特异性活力呈现出先提高后降低的趋势。

从图5-C中可以看出，pH值和提取时间对凝集素特异性活力都呈二次影响，随着提取时间的增加，凝集素特异性活力呈现先增强后减弱的趋势；随着pH值的增加，凝集素特异性活力同样呈先增强后减弱趋势，说明两者的交互作用对蛋白质的提取率均有影响。

综合分析图5-A、图5-B、图5-C可以看出，提取时间和pH值变化时，响应值变化较大，表现为曲线较陡；提取时间和pH值对凝集素的特异性活力影响较明显，料液比影响不大。

2.2.3验证试验对回归模型进行参数优化，分析得到白芸豆凝集素提取最优工艺参数为料液比1g∶10mL，pH值7.5，提取时间20h，特异性活力可達到1209.04HU/mg。

为了验证试验预测结果，用以上优化参数重复试验3次，平均特异性活力为1193.62HU/mg，与理论值偏差1.3%，没有明显差异，试验结果证明，响应面分析法对工艺优化是非常有效的。

2.2.4DEAEA-50阴离子交换层析离子交换层析利用带电分子之间的电荷差异来进行分离。

蛋白质是一种两性电解质，当蛋白质所处环境的pH值发生变化时会引起蛋白质本身所带电荷的变化。

当蛋白质所处的环境pH值等电点（pI）时，带负电；当环境的pH值

凝集素的pi约在5.5～6.0之间，因此采用ph值为7.5的磷酸缓冲液作为洗脱液，选用阴离子交换层析法进行凝集素的分离。

>

将凝集素粗品溶液用水系膜除杂，用pH值7.5、0.05mol/LPB作为上样缓冲液，紫外检测器检测平稳后开始工作。

上样量为3mL，经缓冲溶液洗脱获得第1个吸收峰。

然后按照NaCl浓度0.05、0.20、0.50mol/L的变化梯度进行梯度洗脱。

各浓度梯度洗脱后得到的洗脱结果见图6，其中峰1为PB洗脱液直接洗脱获得的穿透峰，峰2为添加0.05mol/LNaCl的PB洗脱峰，峰3为添加0.20mol/LNaCl的PB洗脱峰，峰1具有凝集能力，其余的则不含有凝集素，因此将经过洗脱后获得的峰1溶液保存备用。

2.2.5SephadexG-75分子筛分子筛层析是依据样品中物质分子的差别而进行分离的，洗脱时分子量大的物质直接被冲洗下来，而分子量小的在洗脱时会进入凝胶孔内增加运行的距离，使得大分子量的先洗脱下来，小分子量的后洗脱下来，从而实现目标产物的分离。

将DEAEA-50纯化后的溶液过水系膜后上SephadexG-75分子筛柱。

用pH值7.5、005mol/LPB作为上样缓冲液，上样量5mL。

得到如图7所示的洗脱结果，经血红细胞检测表明，该凝集素具有凝集活力。

2.2.6SDS-PAGE检测分析通过对比标准分子量蛋白各条带对应的分子量，得知目标蛋白的分子量大小在30～40ku（图8）。

3结论

用Design-Expert7.0统计软件，根据单因素试验和响应面分析试验对白芸豆粗凝集素提取工艺进行优化，采用响应面法对白芸豆凝集素提取方法进行优化，得到拟合方程：

Y=411.13+7.19A+41.65B-31.21C-3.69AB-6.65AC-3971BC-3.45A2-106.41B2-20.67C2，以及提取最优条件：

料液比1g∶10mL，pH值7.5的0.05mol/LPB，提取时间

20h，白芸豆凝集素特异性活力为1193.62HU/mg。

白芸豆凝集素粗品，经过DEAEA-50、SephadexG-75分子筛及SDS-PAGE分析后表明，初步分离产物中白芸豆凝集素的分子量在30～40ku，含量较高。