生化实验修订版1.docx
《生化实验修订版1.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生化实验修订版1.docx（14页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
生化实验修订版1
生物化学实验
实验一、植物基因组DNA提取及含量测定
1、DNA的提取
一目的要求
1.学习植物DNA分离的原理
2.掌握植物基因组DNA提取的方法及含量的测定方法
二实验原理
高浓度的盐和离子表面活性剂SDS能破坏细胞膜，并能解聚脱氧核糖核蛋白复合物（DNP），使DNA释放出来。
苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA则溶于上层水相。
将氯仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA的少量溶解。
95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可除去一些盐分。
三实验材料仪器和药品
仪器设备：
低温离心机,恒温水浴锅,台式离心机,紫外分光光度计，研钵等
药品试剂：
1.细胞提取液:
（100mmol/LTris-HCLpH8.0，50mmol/LEDTApH8.0，500mmol/LNaCl，1.25%SDS）
2.10mmol/Lβ-巯基乙醇
3.4mol/LKCl
4.酚/氯仿/异戊醇（25:
24:
1）
5.异丙醇
6.70%乙醇
7.TE缓冲液
四实验步骤
1.取1g新鲜豆芽,在冰浴中研磨成糊状.
2.转移至5ml离心管中,加入5ml细胞提取液,200ulβ-巯基乙醇充分混匀.65℃水浴保温20min.
3.从水浴中取出离心管,加入1ml4mol/LKCL溶液,混匀,水浴20min.
4.8000r/min离心10min.
5.取3ml上清液转移到另一5ml离心管中.
6.加等体积酚/氯仿/异戊醇混匀,8000r/min离心10min.
7.取上清3ml加等体积酚/氯仿/异戊醇,混匀,8000r/min离心10min.
8.取上清3ml加入2ml异丙醇,混匀.
9.离心,弃上清液获得沉淀,加70%乙醇3ml离心5min,重复3次.风干沉淀.
10.加入500ulTE缓冲液,溶解DNA.
11.进行定量测定.
2、DNA的定量测定：
紫外分光光度法
一、目的和要求
1、学习和了解核酸的定量测定的常用方法。
2、掌握用紫外分光光度法测定DNA的操作方法。
二、原理
核酸含量的测定方法包括紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法。
本实验采用紫外分光光度法，利用DNA在260nm有最大的吸收峰的特性进行测定。
三、操作步骤
以TE作空白调零，将上述提取到的DNA样液稀释后在波长260nm和280nm处分别测定吸光值。
四、结果处理
1、计算样品液中DNA含量（ug）：
DNA[ug/ml]=A260×50×稀释倍数
2、分析样品纯度。
五、注意事项
1.离心管中加入酚/氯仿/异戊醇后，需轻轻倒转混匀，此时注意动作的力度。
2.提取到的DNA样液可逐步进行稀释（参考稀释50倍）。
实验还原糖和总糖的测定
一、目的：
掌握还原糖和总糖定量测定的基本原理，学习比色定糖法的基本操作，熟悉721型分光光度计的使用方法。
二、原理：
各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。
在碱性条件下，还原糖将3,5-二硝基水杨酸还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它产物，在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅的程度呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。
多糖水解时，在单糖残基上加了一分子水，因而在计算中须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9即为实际的总糖量。
三、实验材料、仪器和试剂
1、实验材料：
面粉。
2、仪器：
（1）25ml血糖管或刻度试管×11；
（2）大离心管或玻璃漏斗×2；（3）烧杯：
100ml×1；（4）三角瓶：
100ml×1；（5）容量瓶：
100ml×3；（6）刻度吸管：
1ml×11、2ml×4、10ml×1；（7）恒温水浴；（8）沸水浴；（9）离心机（过滤法不用此设备）；（10）电子天平；（11）分光光度计；
3、试剂：
（1）1mg/ml葡萄糖标准液：
准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至衡重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移至100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：
将6.3g3,5-二硝基水杨酸和262ml2NNaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸甲钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。
冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。
（3）碘-碘化钾溶液：
称取5g碘和10g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中。
（4）酚酞指示剂：
称取0.1g酚酞，溶于250ml70%乙醇中。
（5）6NHCl
（6）6NNaOH
四、操作步骤
1、制作葡萄糖标准曲线：
取7支具有25ml刻度的血糖管或试管，编号，按下表所示的量，精确加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。
数量管号
项目
0
1
2
3
4
5
6
葡萄糖标准溶液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
蒸馏水（ml）
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
3,5-二硝基水杨酸试剂（ml）
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
将各管摇匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25ml刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，则向每管加入21.5ml蒸馏水，混匀）。
在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1-6号管的消光值。
以消光值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
2、样品中还原糖和总糖的测定：
（1）样品中还原糖的提取：
1、准确称取2g食用面粉，放在100ml的烧杯中，先以少量的蒸馏水调成糊状，然后加50ml蒸馏水，搅匀。
2、置于50℃恒温水浴中保温20分钟，使还原糖浸出。
3、取浸提液20ml（10ml离心管2个）离心（3800rpm离心10分钟）。
4、离心的上清液全部收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
（2）样品中非还原糖的水解和提取：
1、准确称取1g食用面粉，放在100ml的三角瓶中，加入10ml6MHCl及15ml蒸馏水，置于沸水浴中加热水解30分钟。
2、取1-2滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液，检查水解是否完全。
如已水解完全，则不显蓝色。
3、待三角瓶中的水解液冷却后，加入一滴酚酞指示剂，以6MNaOH中和至微红。
4、取浸提液20ml（10ml离心管2个）离心（3800rpm离心10分钟）。
5、将上清液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。
6、精确吸取10ml定容过的水解液，移至另一个100ml的容量瓶中，定容，混匀，作为总糖待测液。
（3）显色和比色：
取5支25ml刻度的刻度试管，编号，按下表所示的量，精确加入待测液和试剂。
数量管号
项目
还原糖测定管号
总糖测定管号
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
还原糖待测液（ml）
2
2
0
0
0
总糖待测液（ml）
0
0
1
1
0
蒸馏水（ml）
0
0
1
1
2
3,5-二硝基水杨酸试剂（ml）
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1、加完试剂后，将各管摇匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25ml刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。
2、在540nm波长下，用Ⅲ试管调零（参比液），分别读取1-4号管的消光值。
五、结果与计算：
以管①、②的消光值平均值和管Ⅰ、Ⅱ的消光值的平均值，分别在标准曲线查出相应的还原糖毫克数。
按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
六、附注：
1、标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。
淀粉酶活力的测定
一、目的
学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。
二、原理
淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。
淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。
淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。
α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。
β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。
淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。
用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。
两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。
β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。
根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。
本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。
在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
萌发的小麦种子（芽长约1cm）
2．仪器
（1）离心机
（2）离心管（3）研钵（5）容量瓶：
50mL×1,100mL×1（6）恒温水浴（7）20mL具塞刻度试管×13（8）试管架（9）刻度吸管：
2mL×3,1mL×2,10mL×1（10）分光光度计
3．试剂（均为分析纯）
（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：
精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：
精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL2mol/LNaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。
盖紧瓶塞，勿使CO2进入。
若溶液混浊可过滤后使用。
（3）0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液
A液：
（0.1mol/L柠檬酸）：
称取C6H8O7·H2O21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
B液：
（0.1mol/L柠檬酸钠）：
称取Na3C6H5O7·2H2O29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。
（4）1%淀粉溶液：
称取1g淀粉溶于100mL0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液中。
四、操作步骤
1．麦芽糖标准曲线的制作
取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：
试剂
管号
1
2
3
4
5
6
7
麦芽糖标准液（mL）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
蒸馏水（mL）
2.0
1.8
1.4
1.0
0.6
0.2
0
麦芽糖含量（mg）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
3,5-二硝基水杨酸（mL）
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
摇匀，置沸水浴中煮沸5min。
取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。
以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。
以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
2．淀粉酶液的制备
称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。
将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。
提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。
然后在3000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。
吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。
2．酶活力的测定：
取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。
酶活力测定取样表
操作项目α淀粉酶活力测定β-淀粉酶活力测定
Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3
淀粉酶原液（mL）1.01.01.0000
钝化β-淀粉酶置70℃水浴15min，冷却
淀粉酶稀释液（mL）0001.01.01.0
3,5-二硝基水杨酸（mL）2.0002.00.0
预保温将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min
40℃1%淀粉溶液（mL）1.01.01.01.01.01.0
保温在40℃恒温水浴中准确保温5min
3,5-二硝基水杨酸（mL）02.02.002.02.0
摇匀，置于水浴中煮沸5min,取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。
摇匀，在540nm波长下比色，记录光密度值，从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，用以表示酶活性。
五、结果计算
计算Ⅰ-2、Ⅰ-3光密度平均值与Ⅰ-1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算α-淀粉酶的活力。
计算Ⅱ-2、Ⅱ-3光密度平均值与Ⅱ-1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（α＋β）淀粉酶总活力。
β淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α淀粉酶活力
六、附注
（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。
（2）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。
同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5℃。
（3）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。
七、思考题
1．为什么要将Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅰ-3号试管中的淀粉酶原液置70℃水浴中保温15min？
2．为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40℃水浴中保温？
参考答案
1MTris.HCLpH8.02瓶
三羟甲基氨基甲烷2瓶
1MEDTAPh8.02瓶
乙二胺四乙酸1
NaCl氯化钠1瓶
SDS十二烷基硫酸钠1瓶
β巯基乙醇1瓶
KCl氯化钾一瓶
淀粉1瓶
柠檬酸2瓶
柠檬酸钠2瓶
氢氧化钠1瓶
酒石酸钠，2瓶
麦芽糖1瓶
分析纯葡萄糖1瓶
3,5-二硝基水杨酸2瓶
酒石酸甲钠2瓶
亚硫酸钠，2瓶
碘
碘化钾
酚酞2瓶
乙醇
HCl盐酸
NaOH氢氧化钠
酚（液体）5瓶
氯仿（液体）5瓶
异丙醇10瓶
（1）25ml试管×11；
（3）烧杯：
100ml×1；
（4）三角瓶：
100ml×1；
（5）容量瓶：
100ml×3
（3）容量瓶：
100毫升×1；
（4）具塞刻度试管25毫升×13；
（5）试管：
8支；
（6）刻度吸管：
1毫升×2，2毫升×2；
1MTris
三羟甲基氨基甲烷1瓶
1MEDTAPh8.02瓶
乙二胺四乙酸1
SDS十二烷基硫酸钠1瓶
β巯基乙醇1瓶
KCl氯化钾一瓶
柠檬酸钠2瓶
氢氧化钠1瓶
酒石酸钠，1瓶
麦芽糖1瓶
分析纯葡萄糖1瓶
3,5-二硝基水杨酸2瓶
亚硫酸钠，1瓶
酚酞2瓶
酚（液体）5瓶
氯仿（液体）5瓶
异丙醇10瓶
（1）25ml刻度试管；20个
（4）具塞刻度试管25毫升20个
活性炭口罩6个
眼镜2个
甲基兰1瓶
愈创木酚1瓶
升级会员 