正交试验优化ELISA检测中TMBHRP显色体系的研究.docx

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正交试验优化ELISA检测中TMBHRP显色体系的研究

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正交试验优化ＥＬＩＳＡ检测中ＴＭＢ／ＨＲＰ显色体系的研究

桑延霞，周天鸿，琼莫，邱戋兰，蒋德旗，王从峰，冉艳红，李弘剑１

（口南大学牛命科学与技术学院，１'东广州５ｉ０６３２）

摘要目的建口ＥＬＩＳＡＲ也体系∞优化ｎ法．优化Ｉ'ＭＢ／ＨＰＲⅡ色§\u32479X∞Ⅱ■錾敬方法前先采Ｉ｝】单目隶Ｅ骑研究Ｈ色

体幕巾的缓冲溶液ｐＨ  ＴＭＢ浓度、Ｈ，帆浓度ⅢＩ锄ｔ问ⅧｎＪⅡ¨\u8545XＥ∞蟛响，ｎ此基ｍＪ。

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浓崖☆００３％（Ｖ／ｖ），匣应温度为３０一

５０℃．Ⅱ脯时目～１０ｍｉｎ，结论优化的ＴＭＢ／ＨＲＩ’Ｒ什Ⅱ应条件，ｒⅡ“槽址啦Ⅱ臆的站求．所建立的Ｉ'ＭⅣＨＲＩ’体系的优化方

万方数据

２０１１年２ｌ（２）

法也适用于其它ＥＬＩＳＡ显色系统的优化。

ｌ，

关键词：

ＥＬＩＳＡ；正交试验；ＴＭＢ；ＨＲＰ

生物技术

，

．

中图分类号：

Ｑ５０３  文献标识码：

Ａ  ｄｏｉ：

１０．３９（，９／ｊ．ｉｍａ．１００４－３１ＩＸ．２０１１．０２．０５０

ＯｐｔｍｉｚｉｎｇＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｃｏｎｄｉｃｔｉｏｎｓｏｆ  ＴＭＢ／ＨＲＰ  Ｓｙｓｔｅｍ

ｂｙ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ

、

ＳＡＮＧＹａｈ—ｘｉａ，ＺＨＯＵＴｉａｎ—ｈｏｎｇ，ＣＨＥＮＧ  Ｙｉｎｇ，ＱＩＵ  Ｍｅｉ—ｌａｎ，ＪＩＡＮＧ  Ｄｂ—ｑｉ，ＷＡＮＧ  Ｃｏｎｇ—ｆｅｎｇ，．

ＲＡＮ  Ｙａｈ—ｈｏｎｇ。

ＵＨｏｎｇ—ｊｉａｎ‘

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＪｉｍＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。

Ｇｕａｎ曲ｏｕ５１０６３２．Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：

Ｏｂｊｅｄｉｖｅ，．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ８１１  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｅｓｕｂ６ｔｒａｔｅｓｙｓｔｅｍｏｆＥＬＩＳＡ  ｔｏ  ｏｒ，ｔｉｍｉ舱ｔｈｅ  ｒｅａｅｔｉｏｒｉｐａｒａｍｅｔｅｒｓ

ｏｆｔｈｅＴＭＢ／ＨＲＰｅｈｒｏｍｏｇｅｎｉｅｓｕｉ皓ｔｒａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｅｔｈｏｄ：

Ｓｅｖｅｒａｌｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｅｒｅ  ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｏ  ａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｆｌ'ｅｅｔｓｏｆｃｏｎｃｅｌｒｌ－

ｔｒａｔｉｏｎｏｆＴＭＢａｎｄＨ２０２，ｐＩ－Ｉ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｔｉｍｅ  ０１１  ｅｈｒｏｍｏｇｅｎｉｅｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｂａ艘ｘｌＯｎ  ｔｈｅｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｔｅｓｔｓ，ｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ

ｄｅｓｉｇｎｍｅｔｈｏｄ  ＷａＳ  ｕ８ｅｔｏｆｕｒｔｈｅｒｏｐｔｉｍｉｚｅｒｅａｃｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒ８．Ｒｅｓｕｌｔ?

Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｒｅａｃｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ＷｅｌｒＣ  ｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ—ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ

ｂｕｆｆｅｒｏｆｐＨ  ５．０，２．５ｍｅ／ｍｌＴＭＢ。

０．０３％（ｖ／Ｖ）Ｈ２０２，３０—５０℃ｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｌＯｍｉｎｏｆｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｃｏｎｄｎｓｉｏｌｍ：

‘Ｔｈｅｏｐ－

ｔｉｘｉｕｄ  ｒｅａ６Ｃｔｉｏｎｐａｚａｍｅｔｅｒ８ｏｆＴＮＢ／ＨＲＰｓｙｓｔｅｍ  Ｗｅｌ'ｅ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ａｎｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄ  ＷａＳ  ｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｔｈｅｒｅｈｒｏｍｏｇｅｎｉｅｓｕｂ－

‘

‘

ｓｔｒａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓｏｆＥＬＩＳＡ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：

ＥＬＩＳＡ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；ＴＭＢ；Ｉｔｌｉｐ

ＥＬＩＳＡ试验中的显色过程是决定试验成败的关键，在

ＴＭＢ／ＨＲＰ显色体系中，ＴＭＢ和Ｈ２０２的浓度，显色缓冲溶液

１．２  方法

１．２．１显色液的配制

‘‘

的ｐＨ及显色的温度和时间是影响显色的重要因素。

ＴＭＢ或

Ｈ２０２浓度过低，不能使反应充分进行；而ＴＭＢ或Ｈ：

０：

浓度

过高，则容易导致非特异性显色或抑制Ｈ１１Ｐ酶的活性。

此外，

显色缓冲溶液的ｐＨ值对ＴＭＢ的溶解度及ＨＲＰ的活性也有

一定的影响，因此提高ＴＭＢ溶解度，控制Ｈ：

０：

浓度和ｐＨ值，

精确称取ＴＭＢ溶于ＤＭＳＯ中配成５ｍｇ，'ｍｌ的储备液，置于

４０Ｃ保存。

显色时。

在醋酸钠一柠檬酸缓冲溶液中（ｐＨ  ５．５，

ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠，０．０１３ｒｍｌ／Ｌ柠檬酸，０．５ｎｎｏｉ／ＬＥＤＴＡ。

５％（Ｖ／

Ｖ）甘油）加入ＴＭＢ储备液和心０２，配制成显色液，现用现配ｏ‘

１．２．２间接ＥＵＳＡ法

是ＥＬＩＳＡ显色的关键，同时反应时间和反应温度也是不可忽

略的因素。

由于涉及商业机密，显色液的配方极少公开，有关

间接ＥＬＩＳＡ的方法步骤见参考文献［１］。

１．２．３正交试验

。

一

ＴＭＢ／ＨＲＰ显色参数的报道也非常有限，不能满足实际需要。

因此，本文通过单因素试验，初步探讨了ＴＭＢ／ＩｔＰＲ显色体系

中主要因素对显色反应的影响，并在此基础上，应用正交试验

对各因素的反应参数进行了系统的优化，优选出最佳反应条

件。

这一方法也适用于其它的ＥＬＩＳＡ显色体统的优化。

ｌ材料与方法

１．１材料

１．１．１实验材料

短肽修饰后的胰高血糖素样肽一ｌ（Ｇｌｕｅａｇｏｎ—ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ

—１）ｓＣ为抗原。

Ｓｃ抗原、抗ｓＣ的多克隆抗体及阴性血清均由

作者实验室制备；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔ＩｇＧ购自Ｐｒｏ－

ｔｅｉｎ＂ｌ'ｅｃｈ公司ｏ

１．１．２试剂

ＴＭＢ购自Ｓｉｇｍａ公司；氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钾、十二

水合磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸、双氧水、吐温２０均

为市售分析纯。

收稿日期：

２０１０—１２一１６；修回日期：

２０ｌｌ一０２—２ｌ

作者简介：

桑延霞（１９７７一），女，博士生，研究方向：

幕因工程药物。

发

表论文４篇．Ｅｎｕｉｌ：

ｙｒａｍｇ＠１６３．ｃ：

ＯＩＩＩ。

周天鸿，男，教授，博士生导师．

从事医学分子遗传学和人巨细胞病毒研究，发表论文８０多篇。

?

通

讯作者：

李弘剑（１９６６一）。

女，教授，博士生导师，从事基因工程药物及

人巨细胞病毒研究，发表论文５０余篇，Ｅｍａｉｌ：

ｔｌｉｈｉ＠ｊ咖．ｅｄｕ．∞。

万方数据

以ＴＭＢ浓度、Ｉｔ：

０：

浓度、ｐｉｔ值和反应时间和温度为考察

因素。

根据单因素试验的结果，选取４个水平，做５因素４水平