生物工艺学第九章生物产品分离及纯化技术.ppt
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生物工艺学,国家十一五规划教材生物工艺学（邱树毅主编）配套课件,目录,第一章绪论第二章工业微生物菌种选育、制备与保藏第三章工业培养基及其设计第四章生物工艺过程中的无菌技术第五章生物反应动力学第六章发酵过程原理第七章生物反应器及生物工艺过程的放大第八章生物反应过程参数检测与控制第九章生物产品分离及纯化技术第十章生物产品工艺学及应用,第九章生物产品分离及纯化技术,9.1概述9.1.1生物分离过程的特点9.1.2生物物质分离的一般步骤9.2发酵液的预处理9.2.1加热9.2.2凝聚和絮凝9.2.3调节pH9.2.4加入价廉的无机盐类9.2.5加入助滤剂9.3生物物质固-液分离技术9.3.1发酵液的过滤分离9.3.2发酵液的离心分离,9.4微生物细胞的破碎与分离9.4.1机械法9.4.2非机械法9.5生物物质的分离与提取9.5.1沉淀法9.5.2吸附法9.5.3离子交换法9.5.4萃取法9.6生物物质纯化与精制技术9.6.1色谱分离9.6.2膜分离技术9.6.3结晶技术9.6.4生物产品的干燥,生物产品是通过生物分离技术从微生物发酵的发酵液、动植物细胞培养的培养液、酶反应液及生化产品中提取分离、加工精制而得。
近20年来随着生物技术产业的发展，以及越来越多的具有活性和热敏性生物产品需要分离。
生物产品分离及纯化技术是生物技术中必不可少的极为重要的过程环节。
9.1概述,9.1.1生物分离过程的特点:
生物物质分离技术的手段多种多样。
生物物质分离的技术难度比一般化工产品的大。
因为被提取物浓度低，被提取物杂质多，被提取物的稳定性差，分离提取的技术复杂，费用大。
生物物质分离技术具有一定的弹性。
生物变异性大，各批发酵液不尽相同，发酵液的放罐时间也不一样。
9.1.2生物物质分离的一般步骤生物分离技术笼统的四步骤：
预处理和固液分离：
过滤和离心操作常用于此过程。
如果产物在细胞内，收集细胞后就还要进行细胞的破碎和细胞碎片的分离。
杂质粗分（初步分离）：
用吸附和溶剂萃取等方法。
纯化：
通常利用色谱法、膜过滤法等。
精制：
获得最终产品，通常采用结晶法。
大部分产品还必须进行干燥处理。
设计某一具体产品分离提取工艺时应注意：
所提取物是胞内产物还是胞外产物；产物和主要杂质的浓度；产物和主要杂质的物理化学特性及差异；产品的用途和质量标准；产品的市场价格；废液的处理方法等。
9.2发酵液的预处理,9.2.1加热液体粘度是温度的函数，加热可降低液体粘度，可改善发酵液的过滤特性。
加热是蛋白质变性凝固的有效方法，柠檬酸发酵液加热至80以上，可使蛋白质变性凝固，从而大大提高过滤速度加热处理只适用于对热较稳定的液体。
微生物发酵的发酵液中，发酵产物浓度较低，大多为1%10%，发酵液中大部分是水，发酵液中固体粒子的性质差异很大。
发酵液预处理的目的在于改变发酵液中固体粒子的物理特性，除去高价无机离子和杂蛋白质，降低液体粘度和密度，实现后面的有效分离。
近年来发展了许多种类有机高分子聚合物絮凝剂，它们具有长链状结构，是一种水溶性聚合物，相对分子质量可高达数万至一千万以上，在长链节上含有许多活性功能团，有带电荷基团和不带电荷非离子型基团。
9.2.2凝聚和絮凝凝聚是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的过程。
絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成较大的絮凝团的过程。
凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。
添加适量的凝聚剂和絮凝剂。
可有效地改变悬浮粒子的分散度，使其聚集成较大的颗粒，便于过滤，常用于细小菌体且粘度较大的发酵液预处理中。
有机高分子聚合物絮凝剂,9.23调节pHpH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值便可改变其过滤特性。
蛋白质属两性电解质，两性电解质在溶液中的pH值处于等电点时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的消弱或破坏，分子间引力增加，溶解度最小。
因此，调节溶液的pH，使两性溶质的蛋白质溶解度下降析出。
如味精生产中就是利用等电点（pI3.22）沉淀法提取谷氨酸的。
9.24加入价廉的无机盐类如除去钙离子，可加入草酸钠，生成的草酸钙能促进蛋白质凝固，提高溶液质量。
除去镁离子，可加入三聚磷酸钠，它与镁离子形成不溶性络合物。
用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。
除去铁离子，可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀。
9.2.5加入助滤剂助滤剂是一种具有特殊性能的细粉或纤维，它能疏松滤饼降低了滤饼的可压缩性使滤速加快。
选择和使用助滤剂应考虑以下要点：
助滤剂的粒度:
选择粒度时应根据悬浮液中的颗粒和滤液的澄清度通过试验确定，一般情况颗粒大，过滤速度快，但滤液澄清度差，反之颗粒小，过滤阻力大，澄清度高。
助滤剂的品种:
根据过滤介质选择助滤剂品种。
助滤剂用量:
间歇操作时，助滤剂预涂层的最小厚度是2mm。
连续操作时根据过滤速度和产品浊度来确定。
另外，若助滤剂中某些成分会溶于酸性或碱性液体，对产品有影响时，使用前对助滤剂应进行酸洗或碱洗。
最常用的固液分离主要是过滤和离心分离。
膜分离技术是目前新兴的固液分离方法。
过滤是目前工业生产中用于固液分离的主要方法，其原理是使液体通过固体支撑物或过滤介质，把固体截留，从而达到固液分离的目的。
按过滤时料液流动方向的不同，分为常规过滤（料液流动方向与过滤介质垂直）和错流过滤（料液流动方向与过滤介质平行）。
离心分离是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的分离、浓缩等操作。
离心分离对那些固体颗粒很小且粘度很大、过滤速度很慢甚至难以过滤的悬浮液分离有效，对那些忌用助滤剂的悬浮液的分离，也能得到满意的结果。
9.3生物物质固-液分离技术,9.3.1发酵液的过滤分离在过滤操作中要求对介质选择及操作条件进行优化，才能使滤速快，滤液澄清并且有高的收率。
过滤介质选择过滤介质除过滤作用外，还是滤饼的支撑物。
它应具有足够的机械强度和尽可能小的流动阻力。
过滤介质技术特性包括过滤介质所能截留的固体粒子的大小和对滤液的透过性。
过滤介质所能截留的固体粒子的大小通常以过滤介质的孔径表示。
如纤维滤布所能截留的最小粒子约10m，硅藻土为lm，超滤膜可小于0.5m。
过滤介质的透过性是指在一定的压力差下，单位时间单位过滤面积上通过滤液的体积量，它取决于过滤介质上毛细孔径的大小及数目。
工业上常用的过滤介质主要有：
织物介质（如滤布,其过滤性能受纤维的特性、编织纹法和线型影响），粒状介质（如硅藻土等），多孔固体介质（如如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料）。
纤维的特性,编织纹法和线型,平纹,斜纹,缎纹,过滤速度的强化发酵液多数属于非牛顿型液体，滤渣又是可压缩性的，所以过滤速度很慢的。
提高过滤速度方法:
降低滤饼比阻力r0：
如添加电解质、絮凝剂、凝固剂等，还可以添加硅藻土等助滤剂。
降低滤液粘度：
粘度愈低，过滤阻力愈小。
对某些非热敏性液体可采用提高温度的方法降低其粘度。
降低悬浮液中悬浮固体的浓度x0如果不计滤布阻力，即过滤速度与获得单位体积滤液所形成的滤饼体积成反比。
热处理：
热处理能使蛋白质等胶体粒子变性凝固，滤液黏度降低，使过滤速度大为提高。
对于可压缩性滤饼，滤饼比阻力r0=f（P）r0为滤饼比助力；P为过滤压力差如果发酵液的滤饼是高度可压缩性的，在P低于某一值时，提高P，可以提高过滤速率；当P超过这一值时，继续增加P，r0会同倍数增加，不会提高过滤速率。
所以在过滤发酵液时，最忌一开始就加大过滤压力差P，这样会在滤布表面形成一层紧密的滤饼层，使过滤速率很快降低下来。
离心沉降是利用固液两相的相对密度差，在离心机无孔转鼓或管子中进行悬浮液的分离操作。
离心过滤是利用离心力并通过过滤介质，在有孔转鼓离心机中分离悬浮液的操作。
超离心是利用不同溶质颗粒在液体中各部分分布的差异，分离不同相对密度液体的操作。
离心分离与压滤相比较，分离速度快、效率高、操作时卫生条件好等，适合于大规模的分离过程。
但是，离心分离的设备投资费用高，能耗较大。
9.3.2发酵液的离心分离离心分离是指在液相非均一体系的分离过程中，利用离心力来达到液-液分离、固-液分离或液-液-固分离的方法。
离心分离可分为三种形式-离心沉降、离心过滤和超离心。
离心沉降连续流体对它的浮力D粒子直径；S,粒子、流体密度；g重力加速度；V粒子体积。
由Stockes定律流体对运动粒子的粘滞力连续流体的粘度；u粒子的运动速度；CD=阻滞系数；A粒子在运动方向上的投影面积。
当粒子以匀速运动沉降时有Fg=Ff，所以最终匀速沉降速度为如果粒子在离心力场中沉降，则重力加速度g应换成2r，即离心分离因数根据分离因数的大小，可将离心机分为常速离心机f2105。
沉降式离心机有实验室用的瓶式离心机和工业上用的转鼓离心机，其中无孔转鼓离心机又有管式、多室式、碟片式和卧螺式等几种类型。
离心过滤离心过滤是利用离心力场进行过滤的过程，兼有离心和过滤的双重作用。
离心过滤一般分成三个阶段：
滤饼形成：
悬浮液进人离心机，在离心力的作用下滤液通过过滤面排出，滤渣形成滤饼。
滤饼压缩：
滤饼中的固体物质逐渐排列紧密，空隙减小，空隙间的液体逐渐排出，滤饼体积减小。
滤饼压干：
毛细组织中的液体被进一步排出，越靠近转鼓壁的滤饼越干。
常用的离心过滤设备有三足式离心机、卧式刮刀卸料离心机和卧式活塞推料离心机，另外还有连续沉降-过滤式螺旋卸料离心机。
三足式离心机,卧式活塞推料离心机,卧式刮刀卸料离心机,连续沉降-过滤式螺旋卸料离心机,超离心法超离心法是根据物质的沉降系数、质量和形状的不同，应用强大的离心力，将混合物中的各组分分离、浓缩和提纯的方法。
超离心法是现代生物技术研究领域中不可缺少的实验室分析和制备手段。
利用超离心技术中的差速离心、等密度梯度离心等方法，已成功分离出各种亚细胞物质，如线粒体、溶酶体和肿瘤病毒等。
超离心法是现代生物技术研究领域中不可缺少的实验室分析和制备手段。
超离心机,9.4微生物细胞的破碎与分离,要分离和提取胞内产物，就必须进行细胞破碎，使目标产物释放转入液相，然后进一步分离、纯化。
细胞破碎的方法很多，一般按是否使用外加力分为机械法和非机械法两类。
9.4.1机械法珠磨机实验室用的研磨法，是用氧化铝作为助磨剂来制备无细胞制剂，此法简单但效率低、制备量少。
工业大规模细胞破碎采用珠磨机，它将细胞悬浮液与颗粒直径为0.451mm的玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种破碎程度。
这类装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。
高压匀浆器利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击、撞击使细胞破裂。
它可达较高的破碎率，但不适合丝状菌和革兰氏阳性菌。
通常的压力为5570MPa。
9.4.1机械法超声波法超声波破碎原理：
当超声波在液体中传播时，液体中的某一小区域交替重复地产生巨大的压力和拉力。
由于拉力的作用，使液体拉伸而破裂，从而出现细小的空穴。
这种空穴又受到超声波的迅速冲击而迅速闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内部的液体发生流动，使细胞破碎。
9.4.2非机械法酶溶法酶溶法是利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。
常用的溶酶有溶菌酶，-1.3葡聚糖酶，-1.6葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶等。
应用酶溶时需要选择适宜酶和酶系统，并要确定特定的反应条件，还常附加其它的处理，如辅加高浓度盐及EDTA或利用生物因素等促使微生物对酶溶作用的敏感，以获得一定的效果。
酶溶法主要用于实验室规模。
自溶法自溶法是利用微生物本身产生的酶来溶菌，而不需外加其它的酶。
通常改变其生长的环境，可以诱发产生这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶的目的。
影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。
9.4.2非机械法渗透压法渗透压法（较温和破碎方法）:
将细胞放在高渗透压的介质中，使细胞内外达到平衡后，离心，然后取出细胞快速将细胞转入两倍体积40C的水或缓冲液中，由于渗透压突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。
渗透压冲击方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。
9.5生物物质的分离与提取,沉淀法又称沉析法，是指在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体从溶液中析出的过程。
是经典的分离和纯化生物物质的方法。
目的产物或留在液相（分离与澄清）或留在固相（分离和浓缩）。
更多地用于蛋白质、酶、多肽等大分子物质的分离。
由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法,其沉淀的生物物质还需用色谱分离等方法进一步提纯。
9.5.1沉淀法,根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：
盐析法：
物质在高离子强度溶液中溶解度降低，以至从溶液里沉淀出来的现象；等电点沉淀法：
利用等电点时溶解度最小的原理；有机溶剂沉淀法：
利用丙酮、乙醇等有机溶剂，不需脱盐处理，但易引起蛋白质变性，必须在低温下进行；非离子型聚合物沉淀法：
常用聚乙二醇PEG、聚乙烯基吡咯烷酮PVP和葡聚糖等；聚电解质沉淀法；高价金属离子沉淀法等。
吸附是利用适当的吸附剂，在一定的操作条件下，使有用目标产物被吸附剂吸附，富集在吸附剂表面，然后再以适当的洗脱剂将吸附的物质从吸附剂上解吸下来，从而达到浓缩和提纯的目的。
按吸附作用机理分为:
物理吸附、化学吸附和交换吸附。
物理吸附:
吸附剂和吸附质通过分子间范德华力而产生的吸附作用。
物理吸附无选择特异性，不需要较高的活化能，在低温条件下也可进行，是可逆的。
化学吸附:
吸附剂与吸附质之间发生电子转移，发生化学反应的吸附作用。
化学吸附的选择性较强，需要一定的活化能，是单分子层吸附。
交换吸附:
吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层，吸附剂与溶液间发生离子交换的吸附作用。
9.5.2吸附法,吸附法优点：
可不用或少用有机溶剂；操作简便、安全、设备简单；生产过程中pH变化小，适用于稳定性较差的生化物质。
缺点：
吸附法选择性差、收率不高；无机吸附剂性能不稳定，不能连续操作，劳动强度大；碳粉等吸附剂影响环境卫生等。
吸附过程与原理
（1）常用吸附剂常用的吸附剂主要有活性炭、硅胶、活性氧化铝、合成沸石（分子筛）和大网格吸附剂等。
（2）吸附剂的性能要求:
大的比表面积，颗粒大小均匀，具有一定的吸附分离能力，具有一定的规模及合理的价格。
（3）吸附平衡当吸附剂达到平衡时，其吸附量m与溶液浓度c和温度的关系称为吸附平衡关系。
当温度一定时，吸附量只是浓度c的函数。
m与c关系曲线称为吸附等温线。
常见吸附等温线有弗罗因德利希型，郎缪尔型，凹型，直线型。
吸附等温线,吸附操作方式吸附按操作方式分为分批式吸附和连续式吸附。
影响吸附过程的因素吸附剂的性质:
吸附剂的吸附容量主要与比表面积有关，吸附速度主要与颗粒度和孔径分布有关，吸附剂的机械强度则影响其使用寿命；吸附质的性质:
能使表面张力降低的物质，易为表面吸附；溶质从较易溶解的溶剂中吸附时，吸附量较少；极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质；溶液pH值:
影响吸附剂或吸附质的解离情况，蛋白质或酶类等两性物质，一般在等电点附近吸附量最大；,温度:
升高温度会使吸附量降低；但在低温时升高温度会使吸附速度加快，吸附量增加；盐的浓度:
盐类对吸附作用的影响比较复杂，有的阻止吸附，有的促进吸附，甚至有的吸附剂一定在盐存在下才能进行；吸附质浓度与吸附剂用量:
在稀溶液中吸附量与浓度的一次方成正比；而在中等浓度的溶液中吸附量与浓度的1/n次方成正比；吸附达到平衡时，吸附质的浓度称为平衡浓度，平衡浓度越大，吸附量也越大。
离子交换法是应用合成的离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的物质，依靠库仑力吸附在树脂上，然后用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，达到分离、浓缩、提纯的目的。
广泛用于抗生素、蛋白质、氨基酸、有机酸等工业。
基本原理离子交换树脂是一种不溶性的高分子化合物，分子中含有可解离的、能与溶液中阴阳离子起交换作用的基团，在层析柱上连续添加新的交换溶液，把离子交换剂上的离子全部洗脱下来，同时溶液中的离子全部被交换并吸附在树脂上，在适当的洗脱条件下（改变pH值、增加离子强度）用洗脱液洗脱，便达到分离纯化的目的。
9.5.3离子交换法,离子交换树脂的分类:
离子交换树脂由三部分构成：
载体；活性基团（功能基团）；活性离子（平衡离子）。
（1）阳离子交换树脂：
强酸性阳离子交换树脂（磺酸基团-SO3H和次甲基磺酸基团-CH2SO3H）；弱酸性阳离子交换树脂（羧酸-COOH和酚羟基-OH等）；中强酸性阳离子交换树脂磷酸基团-PO3H2和次磷酸基团-PHO（OH）。
（2）阴离子交换树脂：
强碱性阴离子交换树脂季胺基团-N（CH3）2；弱碱性阴离子交换树脂伯胺基团-NH2、仲胺基团-NHCH3和叔胺基团-N（CH3）2；中强碱性阳离子交换树脂（兼有以上两类活性基团）。
离子交换树脂的分类:
（3）其它类型的树脂：
两性离子交换剂：
两种性质相反的阴、阳离子交换官能团连接在同一树脂骨架上，就构成两性树脂。
选择性离子交换剂（螯合性离子交换树脂）：
与金属离子形成螯合物，具有高的选择特殊性。
吸附树脂（脱色树脂）：
表面积大、多孔、吸附力强、但交换离子能力小，多用于脱色吸附和除蛋白质等。
电子交换树脂（氧化还原树脂）：
交换作用是电子转移，能起氧化还原作用。
离子交换过程:
交换离子从溶液通过液膜扩散到树脂表面（外扩散或膜扩散）交换离子穿过树脂表面向树脂孔内部，达到有效交换的位置扩散（内扩散或粒扩散）交换离子与树脂中的离子进行离子交换（快）被交换下来的离子，在树脂交联网内向树脂表面扩散（内扩散或粒扩散）被交换下来的离子穿过树脂表面的液膜进入溶液主体中（外扩散或膜扩散）。
离子交换反应的速率主要取决于扩散速率，属于内部扩散控制还是外部扩散控制，随操作条件而变。
影响离子交换速度的因素树脂颗粒的大小：
粒度越小，交换速度越快；树脂的交联度：
交联度低，树脂易膨胀，内扩散容易，交换速度加快；溶液中离子浓度：
浓度越低对外扩散速度影响较大，对内扩散影响较小；温度：
温度越高扩散速度越快；离子的大小：
离子小交换速度快；离子的化合价：
化合价越高，库仑力越大，扩散速度就越小。
离子交换的操作方式离子交换操作一般分为静态和动态操作两种：
静态交换又称为间歇操作，是将树脂与交换溶液混合在一定的容器中搅拌，达到平衡后，滤除介质进行洗脱。
动态交换又称为柱式操作，是先将树脂装柱，交换溶液以平流方式通过柱床进行交换。
新树脂装柱后注意洗涤上柱交换方式可采用原液自上向下流的顺流上柱方式或原液自下向上流的逆流上柱方式。
通常是采用顺流上柱。
洗脱一般采取分步淋洗（先用洗脱能力小的溶液，然后依次使用洗脱能力更强的溶液）或梯度淋洗（流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂浓度配比改变流动相的极性）。
再生处理：
离子交换作用的可逆过程，先用清水洗涤，然后用适当浓度的无机酸或碱进行洗涤。
阳离子交换树脂可用稀盐酸、稀硫酸等淋洗；阴离子交换树脂可用氢氧化钠等溶液处理而再生。
离子交换设备离子交换设备可分为间歇式、固定床（优点）、连续式移动床及连续式流动床离子交换设备。
其中固定床离子交换包括活塞式固定床、部分流化的活塞式固定床以及柱式固定床。
9.5.4萃取法,萃取法:
用一种溶剂将产物自另一种溶剂（如水）中提取出来，达到浓缩和提纯的操作方法。
若萃取的混合物料是液体，则此过程是液-液萃取。
如果被处理的物料是固体，则此过程称为液-固萃取（也称为提取或浸取）。
萃取法优点近年来溶剂萃取法和其它新型分离技术相结合，产生了一系列新型分离技术如双水相萃取、反相胶束（胶团）萃取、超临界萃取、液膜萃取等。
（1）物理萃取将萃取剂和料液放在萃取器中，经充分振荡，静置待分层形成两相，即萃余相和萃取相，其过程是自发进行的，溶质自动地从化学势大的一相转移到化学势小的一相。
液-液萃取分离过程液-液萃取法又分为物理萃取和化学萃取。
物理萃取的理论基础是分配定律，而化学萃取服从相律及一般化学反应的平衡规律。
（2）化学萃取化学萃取是伴有化学反应的传质过程。
根据溶质与萃取剂之间发生的化学反应机理，大致可分为五类，即配合反应、阳离子交换反应、离子缔合反应、加合反应和带同萃取反应等。
液-液萃取分类按操作方式分类:
分为单级萃取和多级萃取，后者又可以分为错流萃取和逆流萃取，还可以将错流和逆流结合起来操作。
（1）单级萃取单级萃取只包括一个混合器和一个分离器。
料液F和溶剂S加入混合器中经接触达到平衡后，用分离器分离得到萃取液L和萃余液R。
如分配系数为K，料液的体积为VF，溶媒的体积为Vs，则经过萃取后，溶质在萃取相与萃余相中数量之比值为,
（2）多级错流萃取料液经萃取后，萃余液再与新鲜萃取剂接触，再进行萃取。
第一级的萃余液进入第二级作为料液，并加入新鲜萃取剂进行萃取。
第二级的萃余液再作为第三级的料液，也同样用新鲜萃取剂进行萃取。
溶剂消耗大，萃取液平均浓度低，但萃取完全。
多级错流萃取,液-液萃取中的乳化问题破乳就是利用其不稳定性，削弱破坏其稳定性，使乳状液破坏。
破乳的原理主要是破坏它的膜和双电层，按其方法分为：
变型法:
加入相反的表面活性剂，使乳状液转型反应法:
加入能与之反应的试剂，使之破坏沉淀（例）物理法:
加热是常用的方法离心法:
利用相对密度差异促使分层,（3）多级逆流萃取在多级逆流萃取中，在第一级中加入料液，并逐渐向下一级移动，而在最后一级中加入萃取剂，并逐渐向前一级移动。
料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故称为逆流萃取。
萃取剂消耗少，萃取液平均浓度高。
多级逆流萃取,
（1）双水相萃取原理两种高聚物水溶液相互混合时发生3种相互作用：
互不相溶：
形成两个水相，两种高聚物分别富集于上下两相复合凝聚：
也形成两个水相，但两种高聚物都分配于一相，另一相几乎全部为溶剂水；完全互溶：
形成均相的高聚物水溶液。
水溶性两相的形成条件和定量关系常用相图来表示。
双水相萃取双水相体系:
由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为两相。
一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。
典型的聚合物双水相体系有聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（dextran）,聚丙二醇/聚乙二醇（PEG）和甲基纤维素/葡聚糖等。
相图,
（2）双水相萃取的优点相分离过程温和，生化分子如酶不易受到破坏；双水相系统之间的传质过程和平衡过程快速，能耗较小，可以实现快速分离；易于进行连续化操作；易于放大；选择性高、收率高；操作条件温和。
（3）双水相萃取的影响因素生物物质在双水相中的分配系数主要由氢键、电荷力、范德华力、疏水作用和蛋白质的构象效应所决定。
因此形成相系统的高聚合物相对分子质量和化学性质、被分配物质的大小和化学性质对双水相萃取都有直接的影响。
（具体）（4）亲和双水相技术亲和双水相技术是指在成相高聚物上偶联亲和性配基，以提高溶质的分配系数。
（5）双水相萃取技术的应用,双水相萃取,反胶团萃取反相胶团是表面活性剂分子溶于非极性溶剂中自发形成的聚集体。
表面活性剂分子由亲水憎油的极性头和亲油憎水的非极性尾两部分组成，将表面活性剂溶于水中，并使其浓度超过临界微团浓度（CMC）时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起形成聚集体。
这种聚集体是水溶液中的微团称为正微团。
它可溶解非极性的物质。
若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，使其浓度超过临界微团浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反微团（反胶团）。
它可溶解极性物质。
（1）反胶团的萃取原理蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。
在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形，接着两界面形成含有蛋白质的反胶团，然后扩散到有机相中，从而实现了蛋白质的萃取。
（反萃取）
（2）反胶团萃取的优点反胶团萃取技术成本低，溶剂可反复使用；有很高的萃取率和反萃取率，并具有高选择性；分离、浓缩可同时
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