食品微生物检验.docx

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食品微生物检验

实习报告

实习名称

食品微生物检验课程实习

系别

生物与化学工程系

年级专业

09级食品质量与安全

学生姓名

指导老师

王瑶琼

邵阳学院

2012年1月2日

人们常说，“理论要联系实际”，这次，在学校指导老师的带领下，我们又有一次机会深入到细节中去学习，并在实践中体会理论的应用。

虽然说只历经了短短的两周，但是却给我们带来了很多启示。

总的来说，这次食品微生物课程检验实习，我们收获颇多，受益匪浅。

食品微生物检验实习是食品质量与安全专业、食品科学与工程专业的核心课程，学习过程以实验教学贯穿始终，重点培养我们的实际动手能力，是不可缺少的实践性学习环节。

通过三周实习，我们掌握了培养基的配制、包扎及灭菌；正确采集样品并对样品进行稀释、样品滴加、培养；菌落观察、鉴定与计数；数据处理、分析等方面内容，并通过自主设计实验方案，是我们的知识、能力、素质形成综合的培养。

为我们今后从事各种与食品质量与安全专业、食品科学与工程专业相关的工作打下坚实的基础。

一、实验时间与地点

时间：

12月15日——12月31日

地点：

三栋教学楼104室

二、实习过程概述

12.15上午举行动员大会

12.16至12.18查找资料并设计实验方案。

12.19上午提交实验方案并通过了，再去领实验器材，下午做预备实验，并配制LB、PDA培养基，灭菌，晚上倒平板，做无菌检查。

12.20样品中细菌和霉菌的检测进行十倍稀释、接种

12.21细菌菌落的观察及计数，配制LB、孟加拉红、乳糖发酵培养基，灭菌，倒平板，十倍稀释，接种。

12.22观察乳糖发酵试验以及观察细菌菌落和计数，配制EMB培养基，接种。

12.23观察霉菌菌落和计数

12.25观察酵母菌落和数，EMB纯化培养

12.26观察大肠菌群的菌落

12.27--12.31数据的处理分析，完成实习报告。

三、实习内容

油豆腐中细菌含量的测定：

一、实验材料

1、电热恒温培养箱、冰箱、托盘天平、电磁炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试管架、精灯酒、研钵、剪刀、灭菌镊子、75%酒精棉球、玻璃蜡笔、登记薄

2、培养基和试剂：

75%乙醇、生理盐水、1mol\L氢氧化钠溶液、LB培养基、检验方法

2、检样稀释及培养

（1）以无菌操作，将检样油豆腐25g剪碎、研磨以后，放于盛有225ml无菌水的三角0瓶内，并在三角瓶中放入玻璃珠，经充分振摇做成1：

10的均匀稀释液。

（2）用1ml无菌吸管吸取1：

10稀释液1ml，沿管壁缓慢注入含有9ml无菌水的无菌试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：

100的匀液。

（3）另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。

（4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于无菌培养皿内，每个稀释度作三个培养皿。

（5）稀释液移入培养皿后，应及时用L型玻棒在培养基表面将样品均匀涂布。

（6）等琼脂凝固后，翻转培养皿，置（36±1）℃恒温箱内培养24h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g样品所含菌落总数。

二、菌落计算方法

（1）菌落计数方法

做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。

在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

（2）菌落计数的报告

①平板菌落数的选择

选取菌落数在30～100之间的平板作为菌落总数测定标准。

一个稀释度使用三个平板，应采用三个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。

平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。

②稀释度的选择

应选择平均菌落数在30～100之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。

若所有稀释度平均菌落数均大于100，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。

若所有稀释度的平均菌落数均不在30～100之间，其中一部分大于100或小于30时，则以最接近30或100的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

实验具体流程如下：

下表为实验时记录的绿豆糕中细菌的含量数据：

样品中细菌的含量

稀释度10-210-310-4

平板一729无

平板二81111

平板三10521无

平均菌数

（个/g）3.44×1045.4×1041.3×104

注：

每个平板加入1ml的稀释液

其中，细菌菌落全为白色。

二、油豆腐中霉菌和酵母菌含量的测定

1、设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

1.1冰箱：

2℃～5℃。

1.2恒温培养箱：

25～28℃。

1.3电子天平：

感量0.1g。

1.4无菌锥形瓶:

容量500mL、250mL。

1.5无菌广口瓶：

500mL。

1.6无菌吸管：

1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。

1.7无菌平皿：

直径90mm。

1.8无菌试管:

10mm×75mm。

2、检验程序

3操作步骤

3.1样品的稀释

3.1.1样品预处理：

以无菌操作，将检样油豆腐25g剪碎、研磨以后，放于盛有225ml无菌水的三角瓶内，并在三角瓶中放入玻璃珠，经充分振摇做成1：

10的均匀稀释液。

3.1.2取1mL1:

10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中,另换一支1mL无菌吸管反复吹吸,此液为1:

100稀释液。

3.1.3按3.1.2操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。

每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。

3.1.4根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于3个无菌平皿内。

同时分别取1mL样品稀释液加入1个无菌平皿作空白对照。

3.1.5及时将15mL～20mL冷却至46℃的PDA或孟加拉红培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

4结果与报告

4.1计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。

4.1.2若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

4.1.3若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

4.1.4若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。

4.2报告

4.2.1菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。

4.2.2菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。

4.2.3称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。

A.1PDA培养基

A.1.1成分

马铃薯（去皮切块）150g

葡萄糖10.0g

琼脂10.0g

氯霉素0.05g

蒸馏水1000mL

A.1.2制法

将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸20min。

用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。

加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121.1℃灭菌20min。

倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中，并加入抗生素抑制细菌的生长。

油豆腐中酵母菌检验的流程：

油豆腐中霉菌的检验流程：

下表为实验时记录的绿豆糕中霉菌酵母菌的含量数据：

样品中酵母菌的含量

稀释度10-110-210-3

平板一58132

平板二377无

平板三629无

平均菌数

（个/g）4.2×1027.7×1025.3×102

注：

每个平板加入0.5ml的稀释液

酵母菌菌落呈白色，且表面很潮湿。

样品中霉菌的含量

稀释度10-210-310-4

平板一122无

平板二233无

平板三176无

平均菌数

（个/g）3.4×1037.3×103/

注：

每个平板加入1ml的稀释液

霉菌菌落有菌丝，菌落较大，有白色、黄色、黑色的菌落。

三、油豆腐中大肠菌群的测定

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

食品中大肠菌群数系以100mL（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。

1设备和材料

1.1温箱：

36±1℃。

1.2冰箱:

0～4℃。

1.3恒温水浴:

44.5±0.5℃。

1.4天平。

1.5乳钵。

1.6试管。

1.7吸管。

1.8广口瓶或三角烧瓶:

容量为500mL。

1.9玻璃珠:

直径约5mm。

1.10酒精灯。

1.11试管架。

2培养基和试剂

2.1乳糖胆盐发酵管:

按GB4789.28中4.9规定。

2.2伊红美蓝琼脂平板:

按GB4789.28中4.25规定。

2.3乳糖发酵管:

按GB4789.28中4.10规定。

2.4磷酸盐缓冲稀释液:

按GB4789.28中3.22规定。

2.5革兰氏染色液:

按GB4789.28中2.2规定。

3操作步骤

3.1检样稀释

以无菌操作将检样25g放于有225mL无菌水的灭菌玻璃瓶内（瓶内予置适当数量的玻璃珠）,经充分振摇或研磨做成1:

10的均匀稀释液。

3.2乳糖发酵试验

分别取1ml1:

10的均匀稀释液于9个乳糖胆盐发酵管内，置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。

3.3分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。

3.4证实试验

在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。

凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。

3.5报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。

4大肠菌群

4.1用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物（见3.2条）转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内（水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面）,培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。

4.2结果报告

下表为实验时记录的油豆腐中大肠菌群的含量数据：

1.乳糖发酵罐现象

9只试管中有一支产生气泡，所有的试管都由蓝色变成黄色。

注:

每只试管加入1ml稀释液，产气的现象为杜氏小管中有气泡产生，产酸的现象为培养基颜色由蓝色变为黄色。

2.EMB平板分离现象

注：

每个平板加入1ml

平板

现象

镜检结果（革兰氏染色）

乳糖复发酵结果

试管二

有金属光泽的深色菌落

革兰氏阴性短杆菌

产酸,产气

试管二稀释10倍

有金属光泽的深色菌落

革兰氏阴性短杆菌

产酸,产气

试管三

有金属光泽的深色菌落

革兰氏阴性短杆菌

产酸,产气

试管三稀释10倍

有金属光泽的深色菌落

革兰氏阴性短杆菌

产酸,产气

试验结论:

油豆腐中检测出无大肠菌群。

四、实验经验与心得总结

一、微生物实习过程中心得体会:

1、实习中我们需要树立安全第一的思想，服从领导，尊重指导教师，认真学习，勤于思考！

2、在实习过程中应充分考虑到所处环境与设备的条件，适当更改实验方案，使实验更加合理可靠！

3、在实习过程中，我们应充分考虑到平板涂布时所加入的稀释液的量，太少会使菌落数过少，不利于计数；太多则会导致倒置培养的不便，并会是菌落数过多。

还有就是要考虑好稀释度的问题，不同的样品不可相同，稀释度过高，会导致菌落数过少，稀释度过低则会导致菌落数过多，不利于计数，也容易导致误差，所以，在这两个方面，是需要我们重点考虑的！

4、在实验过程中，我们要注意灭菌和无菌操作的重要性，尽量避免杂菌污染，导致实验误差！

5、每次实验结束时，都需要整理好自己所负责的台面卫生，确保实验室的安全整洁。

6、涂布的时候要均匀，不然菌落生长不均匀。

7、样品预处理时一定要处理的妥当。

二、试验中存在的不足与建议：

1、实验室的样品试剂需好好保存，每次用完后都需盖好放回原处好好保存，防止变质。

2、在做细菌的实验时，我们组做了两次，第一次是因为涂布不均匀，导致菌落只有一处生长，计数无法进行，于是我们将这个实验都重新做了一遍，在做实验时，应该充分考虑到样品的特性，从而设计出合理的实验方案。

3、在做大肠菌群的测定时，杜氏小管需用注射器注满培养基，再倒置后缓缓放入试管中，切忌不可垂直丢入，这样很可能会导致试管破裂，杜氏小管注射培养基时，需注满，不然，放入试管后会导致小管内出现气泡，影响实验结果！

总的来说，这次的微生物课程实习，让我学到了很多，比如说怎样设计实验方案以及团队精神的重要性、操作时操作技术日渐成熟等等，而且，这次的课程实习，让我对自己的实验动手能力有了一个新的认识和提高，能更深刻的认识到自己实验过程中不足的一方面，让自己在日后的学习中能更好地运用操作实验，对自己日后的发展打下了坚实的基础！

五、课后思考题

1、用滤膜法检测大肠菌群有什么优点？

答：

（1）与直接法比较可以检测大量的样品。

（2）浓缩效应使微生物的检测结果提高。

（3）带有菌落的滤膜可作为检测的永久记录存档。

（4）可见的菌落与样品量直接对应，得出定量结果。

2、检查豆制品中的大肠菌群有何意义？

答：

主要是以该菌群的检出情况来表示豆制品中有否粪便污染。

大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。

粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

实习报告书写要求

每次实习结束后，每个学生应按时写出实习报告。

一、实习报告内容提纲

1、实习时间、地点和实习单位；

2、实习过程概述；

3、主要实习岗位和实习内容；

4、实习收获和重要心得体会；（不少于300字，每个人体会不同，雷同重写）

5、存在不足和建议；

6、其他。

二、排版要求

1、统一用A4纸打印；

2、页边距25mm，小标题用四号黑体字，正文内容用小四号宋体，行间距固定值24；插入页码居中，

3、其他参照有关编排规范进行。

注意：

1、学生姓名一栏请注明姓名及学号，如张三（0000001）

2、实习报告提交时间为2013年1月11日