食品微生物检验学.docx
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食品微生物检验学
食品微生物检验学
参考书目及网址：
•
•周阳生（2001）.动物性食品微生物学检验.中国农业出版社
•王自振主编（1991）.食品微生物检验学.中国科学技术出版社
•吴润主编（1997）.食品卫生微生物学检验.甘肃科学技术出版社
•王亚宾主编（2003）.动物性食品检验学.中国科学技术出版社
•刘用成（2006）.食品检验技术-（微生物部分）（适合食品检验与质量控制技术专业）中国轻工业出版社
绪论
一、食品卫生学
¤食品安全，foodsafetyф食品卫生，Food-hygieneandsanitation二者常作为同义词
食品卫生定义为：
“生产、加工、储存、分装和制作食品过程中确保食品安全可靠，有益于健康并且适合人消费的种种必要条件和措施”。
Ж食品卫生学
Foodsafetyreferstotheconditionsandpracticesthatpreservethequalityoffoodtopreventcontaminationandfoodborneillnesses.来源：
http:
//www.nlm.nih.gov/medlineplus/
AlternativeNames（同义词）:
Sanitation-foodandhygiene;Hygiene-foodandsanitation;Food-hygieneandsanitation
1、概念
食品卫生学（Foodhygienics）：
研究食品中存在或从环境可能进入食品、能威胁人体健康的有害物质和因素及其评价方法、预防与控制措施，以提高食品卫生质量，保证食用者安全的学科。
2、食品卫生学研究内容
1）食品的污染问题2）各类食品的卫生问题
3）食物中毒等食源性疾病及其预防4）食品卫生监督管理
它的研究内容主要有食品原料的生产、加工、贮运和产品销售与消费整个过程中可能存在的主要有害物质和因素的种类、来源、性质、作用、含量水平、监督管理以及预防与控制措施，各类食品的主要安全与卫生问题，特别是食物中毒及其预防、控制和管理等。
3、食品卫生学的展望在今后一段时间内，我国在保证食品安全方面需要着重开展以下工作：
（1）、加大人力和物力的投入力度，进行相关理论的研究和技术的开发；
（2）、以现代食品安全控制的最新理论和技术，不断制定和修订各项食品安全与卫生技术规范，并加以落实；
（3）、不断完善相应的法律法规，加强法制管理，明确执法机构人员的职责；
（4）、对食品生产的环境开展有害物的背景值调查，对各种食品中的危害因子进行系统地检测与分析，为食品安全的有效控制提供基础数据和信息；
（5）、研究食物中毒的新病原物质，提高食物中毒的科学评价水平和管理水平；
（6）、进一步推广良好操作规范（GMP）和危害分析与关键控制点（HACCP）等有效的现代管理与控制系统；
（7）、提高食品毒理学、食品微生物、食品化学等学科的研究水平，并将这些研究领域的成果不失时机地应用于食品安全保障工作之中；
（8）、对全体国民加强新知识、现代技术和食品安全基本常识的宣传与教育，加强相关法制法规约教育，提高广大民众自我保护意识；
（9）、研究WTO规则中有关食品安全的条例，充分应用和有效工对国际食品贸易中与食品安全相关的技术壁垒，以保护我国的经济利益和广大民众的生命安全；
（10）、加强国际合作，同FAO、WHO等国际专门机构或组织进行经常性的沟通与合作，不断就世界范围的食品污染物和添加剂的评价、制订ADI值、食品规格、监督管理措施等问题提出意见或建议，维护我国在处理有关食品安全国际事务中的权力和利益。
一些术语:
–良好操作规范（GMP）——GoodManufacturingPractices
–危害分析与关键控制点（HACCP）——HazardAnalysisandCriticalControlPoint
–WTO——Worldtradeorganization
–FAO——FoodandAgricultureOrganization
–ADI——acceptabledailyintake每日允许摄入量
二、食品微生物检验学
1、概念
食品微生物检验学是运用微生物学的理论与技术，研究食品中微生物的种类、特性等，建立食品微生物学检验方法和确定食品卫生的微生物学标准的一门应用性科学。
2、特点
1）研究对象以及研究范围广:
食品种类多，各有特色，分布不同；微生物的种类非常多，数量巨大；在食品来源、加工、运输等都可能受到各种微生物的污染。
2）涉及学科多样:
涉及生物学、生物化学、工艺学、发酵学等方面的知识，以及兽医学方面的知识等。
3）实用性及应用性强:
在促进人类健康方面起着重要的作用。
检验——利用、控制微生物——防止食品变质和杜绝因食源性病害——保证食品卫生的安全。
4）采用标准化（受法规约束）:
《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法》是法定的检验依据。
3、目的为生产出安全、卫生、符合标准的食品提供科学依据，保证人类获得符合卫生要求、适于人类消费的食品。
4、食品微生物检验学的任务
1）研究各类食品中微生物种类、分布及其特性
2）研究食品的微生物污染及其控制，提高食品的卫生质量
3）研究微生物与食品保藏的关系
4）研究食品中的致病性、中毒性、致腐性微生物
5）研究各类食品中微生物的检验方法及标准
5、食品微生物检验的发展
食品微生物检验学的发展是与整个微生物学的发展是分不开的。
人类很早就开始利用微生物的许多特性为人类的生产、生活服务，古代人类早已将微生物学知识用于工农业生产和疾病防治中，公元前二千多年的夏禹时代，就有仪狄酿酒的记载。
北魏（公元386～534年）《齐民要术》一书中详细记载了制醋的方法。
长期以来民间常用的盐腌、糖渍、烟熏、风干等保存食物的方法，实际上正是通过抑制微生物的生长而防止食物的腐烂变质。
在预防医学方面，我国自古就有将水煮沸后饮用的习惯。
明朝李时珍在《本草纲目》中指出，将病人的衣服蒸过后再穿就不会传染上疾病，说明已有消毒的记载。
1）致病菌检测阶段
微生物的发现：
首先观察到微生物的是荷兰人吕文虎克（AntoryVanLeeuwenhoek，1632～1723）。
他于1676年用自磨镜片制造了世界上第一架显微镜（约放大300倍），并从雨水、牙垢等标本中第一次观察和描述了各种形态的微生物，为微生物的存在提供了有力证据，并确定了细菌的三种基本形状：
球菌、杆菌和螺旋菌，吕文虎克也被称为显微镜之父。
微生物与食品腐败：
法国科学家巴斯德（LouisPasteur,1822～1895）首先实验证明有机物质的发酵与腐败是由微生物作用的结果，而酒类变质是因污染了杂菌，从而推翻了当时盛行的自然发生说。
巴斯德病原体研究和预防方面也作出了卓越的贡献，他发明了巴氏消毒法，被称为现代微生物学之父。
病原微生物：
19世纪末至20世纪初，在巴斯德和科赫光辉业绩的影响下，国际上形成了寻找病原微生物的热潮。
有关食品微生物学方面的研究也主要是检测致病菌。
我国从50年代起开始对沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌等食物中毒菌进行调查研究，并建立了各种食物中毒的细菌分离鉴定方法。
2）指示菌检测阶段
在我国，80％的传染病是肠道传染病，为了预防肠道传染病，各种食品微生物的检验方法和检验标准的制定，是食品微生物检验的重要研究内容之一。
通过这些方法和标准，可以检测并判断水、空气、土壤、食品、日常用品以及各类公共场所的安全卫生状况。
但是，直接检测目的病原微生物，难（why?
）
需寻找带有指示性的微生物（指示菌）根据其检出情况，判断样品被污染程度，并间接指示致病微生物有无存在可能，以及对人群是否构成潜在威胁。
指示菌（IndicatorOrganism）：
是在常规安全卫生检测中，用以指示检验样品卫生状况及安全性的指示性微生物。
检验指示菌的目的，主要是以指示菌在检品中存在与否以及数量多少为依据，对照国家卫生标准，对检品的饮用、食用或使用的安全性作出评价。
这些微生物应该在环境中存在数量较多，易于检出，检测方法较简单，而且具有一定的代表性。
指示菌可分为三种类型：
A评价被检样品一般卫生质量、污染程度以及安全性的指示菌…最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌数。
B粪便污染的指示菌……主要指大肠菌群。
其他还有肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等。
其检出标志着检品受过人、畜粪便的污染，而且有肠道病原微生物存在的可能性。
C其他指示菌……包括某些特定环境不能检出的菌类，如特定菌、某些致病菌或其他指示性微生物。
3）微生态制剂检测阶段
19世纪人们就发现并开始认识厌氧菌（巴斯德，1863），但直到20世纪70年代了解到厌氧菌主要是无芽孢专性厌氧菌后，才开始重新重视其研究。
厌氧菌广泛分布在自然界，尤其是广泛存在于人和动物皮肤和肠道。
生态平衡时，与人和动物体“和平共处”。
生态失调时，成为条件致病菌（opportunisticorganism），形成厌氧菌感染症。
由此，市场上出现了以乳酸菌、双歧杆菌为主的各种微生态制剂后（1980s以来），检验其菌株特性和数量就成了目前食品微生物检测的一项重要内容。
4）现代基因工程菌和尚未能培养菌的检测
§转基因动物、植物和基因工程菌被批准使用以及进入商品化生产，加大了食品微生物检测的任务。
§目前也发现了一些尚未能培养的微生物，这也促进了食品微生物检验技术的发展。
§在微生物应用技术、实验方法方面也有极其迅速的发展。
如电镜技术的进步，并结合生物化学、电泳法、免疫化学等的技术，推动了对微生物的分类和鉴定。
荧光抗体技术、单抗技术、PCR技术等，也进一步促进了微生物检验的发展。
6、我国食品微生物检验机构
1）进出口检验国家质量监督检验检疫总局（网站：
2）国内检验
Ф中国疾病预防控制中心（CDC）营养与食品安全所是我国食品卫生检验评价的权威机构。
Ф食品卫生监督机构：
各级卫生局下属卫生监督所
Ф屠宰检验：
兽医卫生监督所+单位自检
Ф食品加工企业自检
食品微生物检验学作为给人类提供有益于健康、能确保食用安全的食品的科学保障之一，业已受到人们的重视，有着广阔的发展前景。
HACCP是危害分析关键控制点（英文HazardAnalysisCriticalControlPoint）的简称。
它作为一种科学的、系统的方法,应用在从初级生产至最终消费过程中，通过对特定危害及其控制措施进行确定和评价，从而确保食品的安全。
HACCP的概念起源于20世纪的美国，在开发航天食品时开始应用HACCP原理
HACCP主要包括7个基本原理：
原理一：
进行危害分析。
原理二：
确定各关键控制点。
原理三：
制定关键限值。
原理四：
建立一个系统以监测关键控制点的控制情况。
原理五：
在监测结果表明某特定关键控制点失控时，确定应采取的纠正行动。
原理六：
建立认证程序以证实HACCP系统在有效地运行。
原理七：
建立有关以上原则和应用方面各项程序和记录的档案。
第一章微生物检验鉴定技术
第一节微生物检验基本知识
包括显微镜检、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等
一、接种（inoculation）
将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
1.接种工具接种针接种环接种钩玻璃涂棒接种圈接种锄小解剖刀
2.常用的接种方法有以下几种：
1）划线接种最常用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
2）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。
此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
3）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常用。
用的接种工具是接种针。
培养基一般是半固体培养基
4）倾注接种该法是将待接种微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，以达到稀释菌液的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
5）涂布接种先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，使菌液均匀分布，即可长出单个菌落。
6）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中；或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，都属于液体接种。
7）注射接种用注射的方法将微生物转接至活的生物体内，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种。
8）活体接种是专用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法。
所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。
接种的方式有注射、灌喂、拌料喂养等。
3.无菌操作（Aseptictechnique）
培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。
在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。
二、分离纯化（Isolation）
含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixedculture）。
如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pureculture）。
在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。
得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。
1、倾注平板法（Pourplate）2、涂布平板法（Spreadplate）
3、平板划线法（Streakplate）
常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
4、富集培养法
富集培养法的方法和原理非常简单。
我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其它微生物。
如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。
通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
5、厌氧法
在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把它放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出溶解氧。
然后快速冷却，并进行接种。
接种后，加入无菌石蜡于培养基表面，使与空气隔绝。
另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。
有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。
三、培养
1、根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养。
好氧培养（AerobicIncubation）：
也称“好气培养”。
厌氧培养（AnaerobicIncubation）：
也称“厌气培养”。
2、根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类：
固体培养：
solidincubation液体培养：
liquidincubation
第二节微生物常规鉴定技术
一、形态结构和培养特性观察
1、微生物的形态结构观察
微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
2、微生物培养特性观察
革兰染色法，丹麦病理学家C.Gram1884年创立
（1）涂片
（2）晾干（3）固定（4）结晶紫色染色：
1min。
水洗（5）媒染：
滴加卢哥氏碘液，媒染1min。
水洗（6）脱色：
将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20～25s至流出液无色，立即水洗。
（7）复染：
滴加蕃红复染5min。
水洗（8）晾干：
晾干或者用吸水纸吸干。
（9）镜检：
先用低倍，再用高倍，最后用油镜。
（10）实验完毕后的处理：
①浸过油的镜头：
a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。
b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2～3次。
c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2～3次。
注意擦镜头时向一个方向擦拭。
②细菌染色玻片用废擦镜纸将香柏油擦干。
微生物培养特性的观察是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
1）细菌的培养特征包括以下内容：
在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。
在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。
半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
2）霉菌酵母菌的培养特征：
大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。
液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。
霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：
孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。
霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
二、生理生化试验
微生物生化反应：
指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。
因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。
微生物检验中常用的生化反应有：
糖或醇类发酵试验淀粉水解试验V-P试验甲基红（MR）试验靛基质（Indole）试验
过氧化氢酶试验硝酸盐还原试验明胶液化试验尿素酶（Urease）试验氧化酶试验
硫化氢（H2S）试验三糖铁（TSI）琼脂试验氨基酸脱羧酶的测定耐盐性试验卵磷脂酶的测定
石蕊牛奶反应酪蛋白水解苯丙氨酸脱氨试验氰化钾试验对叠氮化钠的抗性
硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验含碳化合物的利用（柠檬酸盐或丙酸盐利用）
三、血清学试验
血清学反应是指：
相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。
在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。
在细菌的检测中，应用最多的是凝集试验、沉淀反应和补体结合试验。
血清学试验的一般特点：
1）抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。
2）抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。
3）抗原体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。
4）血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。
第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。
第二阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。
反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。
而且，在第二阶段反应中，电解质、PH、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。
1、凝集反应（Agglutinationreaction）
颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。
其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。
1）直接凝集反应：
a.玻片凝集法；b.试管凝集法2）间接凝集反应
2、沉淀反应（Precipitationtest）
可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。
由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，故应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。
1）环状沉淀反应2）絮状沉淀反应3）琼脂扩散试验
3、补体结合反应（Complementfixationreaction）
补体结合反应是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。
补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。
如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合，就会出现溶血现象;如果与细菌及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象。
因此，如果出现溶菌，说明抗原抗体是相对应的（试验结果阳性）；如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应（阴性）。
此反应操作复杂，敏感性高，特异性强，能测出少量抗原和抗体，所以应用范围较广。
其它方法：
荧光抗体技术,ELISA,免疫组化
第三节食品微生物检验
新技术本节为自学内容，请查阅相关文献，下次上课将抽查
主要参考文献：
以下文献通过我校图书馆“维普期刊”均可查到
•食品微生物检验技术的研究进展[现代食品科技]张洁梅
•病原微生物检验新技术研究进展[畜禽业]许信刚,张琪
•食品中病原微生物快速检测方法研究进展[食品研究与开发]宋宏新,马娜
•食品微生物检验新方法简介[现代食品科技]郑东宏
•核酸杂交技术在食品微生物检验中的应用[中国卫生检验杂志]何宏艳
•膜过滤法微生物检验简介--快速微生物检验法与检测[中国食品工业]王震
•食品安全的微生物学检验的质量控制[食品科技]姚明兰,吴定,刘长鹏，
•关于食品卫生微生物检验方法若干问题的探讨[中国卫生检验杂志]胡巅
•国内外的食品微生物检验[检验检疫科学]李志勇,胡小云,凌莉
•微生物快速检验最新进展[食品研究与开发]刘炳智,朱蓓,王涛
微生物检验新方法
1检查某些细菌的专有酶及代谢产物进行快速鉴定
2应用免疫学方法检测微生物抗原或抗体：
放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、荧光免疫分析（FIA）、化学发光免疫分析（CIA）、生物发光免疫分析（BIA）等
3细菌毒素的快速检测
4细菌对抗菌药物的敏感性试验的快速检测
5分子生物学技术在检测微生物中的应用核酸探针（Nuclearacidprobe）、聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR）、基因芯片技术（microarray）
6快速检测细菌生化反应及成套鉴定系统
7病原微生物的自动化系统：
最有代表性的是AMS微生物自动分析系统。
放射免疫分析（RIA）酶免疫分析（EIA）荧光免疫分析（FIA）化学发光免疫分析（CIA）生物发光免疫分析（BIA）
核酸探针（Nuclearacidprobe）聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR）基因芯片技术（microarray）
AMS微生物自动分析系统3M快速检验方法
第二章食品微生物检验的一般程序
第一节食品检验样品的采集
采样（Sampling）从产品中抽取少量的、有一定代表性的样品，供检验分析用，这一过程称为采样。
一、食品检验样品采集的原则
1.采样前的一些准备工作
–干冰：
制冷剂。
也可以用湿冰。
–盒子或制冷皿：
贮藏、运输样品。
–灭菌容器：
从塑料袋到灭菌的加仑漆桶等。
–取样工具：
茶匙、角匙、尖嘴钳、镊子、量筒和烧杯等。
–灭菌手套：
–无菌棉拭子：
一般用于拭取仪器设施和工厂环境区域。
–灭菌全包装袋：
装样品用。
•当样品收集时，样品采集时的条件例如产品的温度、地点等，连同扦样样品号唛头，一并记录入检验员的注释说明中。
•当采集无菌样品时，一条最重要的规则是：
千万别污染样品。
这需要样品采集人非常小心地采集所有附加样品，确保不违反这条规则。
2.食品检样采集的原则
1）所采样品应具有代表性。
2）采样必须符合无菌操作的要求，防
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