USP34 62 非无菌产品的微生物检测特殊微生物的检测.docx
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USP3462非无菌产品的微生物检测特殊微生物的检测
62非无菌产品的微生物检测：
特殊微生物的检测
简介
下述试验用于在指定条件下可被检出的特殊微生物的的存在和限度。
试验设计主要用于检测物质或者制剂是否符合已经建立的微生物质量的要求。
当用于这个目的时，下面给出了一些说明操作，包括取样量、结果的解释说明。
其他微生物检测方法包括自动化法只要已被证明其等价于药典方法，则可以使用。
通用方法
按“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”章所示进行样品的制备。
如果所检产品有抗菌活性时，请按“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”章所述尽可能的消除和中和。
如果样品准备中需要使用到表面活性剂时，其对微生物的毒力和它与灭活剂的兼容性应像“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”章中一样体现出来。
培养基的促生长与抑制性能，试验方法的适用性和阴性对照
建立有样品的条件下，微生物检测的测试性能状况。
当检验条件改变或样品改变时，因影响其测量结果，则应确定其适用性。
试验菌株的制备
用标准的、稳定的试验菌株悬浮液或者将它们按以下步骤制备。
因使用种子批培养保留技术（种子批技术），则用于接种的可用的微生物从原始的第一代开始继代培养不能超过5代。
好氧微生物
将各试验菌株单独的培养于酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基中，条件为
30-35℃，18-24h。
将白色念珠菌培养于沙氏葡萄糖琼脂或肉汤培养基中2-3天。
温度为20-25℃。
金黄色葡萄球菌
如ATCC6538,NCIMB9518,CIP4.83或NBRC13276
绿脓杆菌
如ATCC9027,NCIMB8626,CIP82.118或NBRC13275
大肠杆菌
如ATCC8739,NCIMB8545,CIP53.126或NBRC3972
血清型鼠伤寒沙门氏菌
如ATCC14028
血清型奥博尼沙门氏菌
如NBRC100797,NCTC6017或CIP80.39
白色念珠菌
如ATCC10231,NCPF3179,CIP48.72或NBRC1594
用PH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液或PH7.2的磷酸盐缓冲液来制备菌悬液，在2h内应用或在2-8℃下24h应用。
梭菌属
采用产气荚膜梭菌如ATCC11437（NBRC14293,NCIMB12343,CIP100651）或ATCC19404（NCTC532或CIP79.03）或NBRC14293。
在无氧条件下，将梭菌试验菌株培养于富营养培养基中24-48h，温度为30-35℃。
然后稀释产气荚膜梭菌的新鲜营养物得到稳定的孢子悬浮液用于实验接种。
将稳定的孢子悬浮液在有效期内储存于2-8℃的条件中。
阴性对照
为了验证实验条件，用所实验准备过程中的稀释剂做阴性对照。
它不能有微生物生长。
第4部分的产品检测中也要有阴性对照。
如果阴性对照失败，应进行调查。
培养基的促生长和抑制能力
检测每一批制备好的培养基，和由脱水制备或者按成分制备每一批培养基。
并按表1中所描述的验证相关培养基的适用性。
表1培养基的促生长，抑制和指示能力
培养基
特性
试验菌株
耐胆汁的G-菌的检测
Mossel-肠细菌富营养肉汤培养基
促生长
大肠杆菌、绿脓杆菌
抑制
金黄色葡萄菌
紫红色胆汁葡萄糖琼脂
促生长+指示
大肠杆菌、绿脓杆菌
大肠杆菌的检测
MacConkey肉汤培养基
促生长
大肠杆菌
抑制
金黄色葡萄菌
MacConkey琼脂培养基
促生长+指示
大肠杆菌
沙门氏菌的检测
Rappaportvassiliadis沙氏富营养肉汤培养基
促生长
鼠伤寒沙门氏菌、奥博尼沙门氏菌
抑制
金黄色葡萄菌
木糖、赖氨酸、脱氧胆酸琼脂培养基
促生长+指示
鼠伤寒沙门氏菌、奥博尼沙门氏菌
指示
大肠杆菌
绿脓杆菌的检测
溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基
促生长
绿脓杆菌
抑制
大肠杆菌
金葡菌的检测
甘露醇琼脂培养基
促生长+指示
金黄色葡萄菌
抑制
大肠杆菌
梭菌的检测
梭菌富营养培养基
促生长
梭菌芽孢
哥伦比亚琼脂培养基
促生长
梭菌芽孢
白色念珠菌的检测
沙氏葡萄糖肉汤培养基
促生长
白色念珠菌
沙氏葡萄糖琼脂培养基
促生长+指示
白色念珠菌
培养基的促生长性能检测，液体培养基——接种少量的（≤100cfu）、合适的微生物菌种于培养基中，在指定温度下培养，时间不超过实验室菌种的最短培养时间。
能获得与以前测试过的、经批准的培养基相比较有清晰可见的微生物生长。
培养基的促生长性能检测，固体培养基——用表面扩散法（看“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”章节中的“倒平板法”）接种少量的（≤100cfu）、合适的微生物菌种于培养基中，在指定温度下培养，时间不超过实验室菌种的最短培养时间。
微生物的生长与以前测试过的、经批准的培养基相比较。
培养基的抑制性能检测，固体或液体培养基——接种至少100cfu的合适菌种于适当的培养基中，在指定温度下培养，培养时间不少于实验室菌种的最长培养时间。
没有试验菌的生长。
培养基的指示性——用表面扩散法（看“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”
章节中的“倒平板法”）接种少量的（≤100cfu）、合适的菌种于适当的培养基中，在规定
温度下培养，时间在以前的菌种培养时间范围内，将菌落的形态和指示性与测试过的、经批
准的培养基相比较。
检测方法的适用性
按“样品检测”中相关段落中的方法准备用于检测的样品，将实验菌种接种于指定的生长培养基中，独立的接种各试验菌株。
取不超过100cfu的菌种用于试验接种。
按“样品检测”中相关段落中规定的最短时间进行培养。
按“样品检测”中描述的指示反应必能检测到特殊微生物。
如果产品有抗菌活性时，应进行方法的修正（看“<61>非无菌产品的微生物检验：
微
生物计数检测”章节中的“抗菌活性的中和/去除”）。
如果给定的产品对某种微生物具有抗菌活性且在检测中规定不能被中和时，我们可视其产品中无被抑制的微生物。
产品测试
耐胆汁的G-菌
样品的制备与预前培养——按“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”中
描述的那样制备成1:
10的稀释液，其试验时，至少有1g的产品用于检测，且用酪蛋白大豆肉汤培养基稀释菌种，混匀，在20-25℃条件下培养一段时间以保证菌种的复苏但不繁殖（常为2h，不超过5h）。
不存在试验——除了特别规定外，用按“样品的制备与预前培养”所准备的含1g的样品接种于Mossel-肠细菌富营养肉汤培养基中，在30-35℃条件下培养24-48h。
然后在紫红色胆汁葡萄糖琼脂培养基上次培养，条件为30-35℃，18-24h。
如果无菌落生长，则产品通过检测。
定量试验——
选择和次培养——将“样品的制备与预前培养”所准备的样品或分别含0.1g,0.01g,
0.001g（0.1ml,0.01ml,0.001ml）产品的稀释液接种于肠细菌富营养肉汤培培养基-Mossel中用于检测，培养条件为30-35℃，24-48h。
然后在紫红色胆汁葡萄糖琼脂培养基上次培养，条件为30-35℃，18-24h。
诠释——有菌落生长时，其结果为阳性结果。
记录最少产品用量为阳性结果，最多产
品用量为阴性结果。
从表2中查得最大可能细菌数。
表2.6.13-5——结果的诠释
各个产品量的结果
每g或每ml产品的最可能细菌数
0.1g或0.1ml
0.01g或0.01ml.
0.001g或0.001ml
+
+
+
＞103
+
+
-
＜103和＞102
+
-
-
＜102和＞10
-
-
-
＜10
大肠杆菌
样品的制备与预前培养——按“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”中方
法制成1:
10的稀释液，其试验时至少有1g产品用于检测，取10ml或相当于1g或1ml产
品的样品体积接种于适量的（“检测方法的适用性”中有描述）酪蛋白大豆肉汤培养基中，培养
条件为30-35℃，18-24h。
选择与次培养——将上述培养基摇匀，取1ml的酪蛋白大豆肉汤培养基到100mlMacConkey
肉汤培养基中培养，条件为42-44℃，24-48h。
然后在MacConkey琼脂培养基中次培养，条
件为30-35℃，18-72h。
诠释——若有菌落生长，则可能为大肠杆菌。
通过鉴别试验进行证明。
若无菌落生长或鉴别结果为阴性，则产品通过此项检测。
沙门氏菌
样品的制备与预前培养——按“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”所述制
备样品。
用不少于10g或10ml量的样品接种于适量的（在“检测方法的适用性”中有描述）
酪蛋白大豆肉汤培养基中，培养条件为30-35℃，18-24h。
选择与次培养——取0.1ml的酪蛋白大豆肉汤培养基于10ml的Rappaportvassiliadis沙氏富营养肉汤培养基中培养，条件为30-35℃,18-24h。
然后在木糖、赖氨酸、脱氧胆酸琼脂培养基中次培养，条件为30-35℃,18-48h。
诠释——若有生长良好，中心可能为黑色的红色菌落可能是沙门氏菌。
通过鉴别试验进行进
一步证明。
如果培养基上无上述特征菌落或鉴别结果为阴性时，则产品通过此项检测。
绿脓杆菌
样品的制备与预前培养——按“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”所述
制成1:
10的稀释液，其稀释程度要求：
试验时不少于1g产品用于检测。
取10ml或相当于
1g或1ml产品的样品量接种于适量的（在“检测方法的适用性”中有描述）酪蛋白大豆肉
汤培养基中，混匀。
当检测贴剂时，取1副贴剂样品（看“<61>非无菌产品的微生物
检验：
微生物计数检测”中的贴剂样品的制备）通过无菌薄膜进行过滤，然后将膜放入100ml
的酪蛋白大豆肉汤培养基中培养，其条件都为30-35℃，18-24h。
选择与次培养——在溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基中进行次培养，条件为30-35℃，
18-72h。
诠释——若有菌落生长时则可能为绿脓杆菌，通过鉴别试验进行证明。
若无菌落生长或鉴别结果为阴性时，则产品通过检测。
金黄色葡萄球菌
样品的制备与预前培养——按“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”所述
制成1:
10的稀释液，其稀释程度要求：
试验时至少有1g产品用于检测。
取10ml或相当于
1g或1ml产品的样品量接种于适量的（在“检测方法的适用性”中有描述）酪蛋白大豆肉
汤培养基中，混匀。
培养条件为30-35℃，18-24h。
当检测贴剂时，取1副贴剂样品（看“<61>
非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”中的贴剂样品的制备）通过无菌薄膜进行过滤，
然后将膜放入100ml的酪蛋白大豆肉汤培养基中培养，其条件都为30-35℃，18-24h。
选择与次培养——在甘露醇盐琼脂培养基中次培养，条件为30-35℃，18-72h。
诠释——若周围有黄色区域的黄色菌落生长，则可能为金黄色葡萄球菌。
通过鉴别试验进
行证明。
若无上述菌落生长或鉴别结果为阴性时，产品通过此项检测。
梭菌
样品的制备与加热处理——按“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”所述制
成1:
10的稀释液（最小的总体积为20ml），且试验时至少有2g或2ml产品用于检测。
然
后将样品分为2组，每组10ml。
1组在80℃中加热10min并迅速冷却。
另1组不加热。
选择与次培养——两组中都取10ml或相当于1g或1ml产品的样品量接种于适量的（在“检
测方法的适用性”中有描述）梭菌富营养培养基中，混匀。
在无氧条件下培养条件为30-35
℃，48h。
然后取培养物在哥伦比亚琼脂培养基上次培养，条件为：
无氧下30-35℃，48-72h。
诠释——若生长的厌氧棒状菌（有或无内生孢子）表现为过氧化氢酶试验阴性时，则为梭
菌。
通过鉴别试验进行证明。
若生长菌落无上述现象或鉴别结果为阴性时，产品通过此项检测。
白色念珠菌
样品的制备与预前培养——按“<61>非无菌产品的微生物检验：
微生物计数检测”所述准
备样品，取10ml或相当于不少于1g或1ml产品的样品量接种到100ml的中沙氏葡萄糖肉
汤培养基中，混匀。
培养条件为30-35℃，3-5天。
选择与次培养——在沙氏葡萄糖琼脂培养基中次培养，条件为30-35℃，24-48h。
诠释——若有白色菌落生长，则可能为白色念珠菌。
通过鉴别试验进行证明。
若无上述菌落生长或鉴别结果为阴性时，产品通过此项检测。
推荐的溶液和培养基
注——这部分是给出的信息。
下列的溶液及培养基可满足药典对微生物污染检测试验规定的要求。
如果证明了其他培
养基的适用性，则也可用其他培养基。
储存缓冲液：
称取34g磷酸二氢钾到1000ml的容量瓶中，用500ml纯化水溶解，用氢氧化
钠调节pH=7.2±0.2，然后用纯化水稀释至1000.0ml，混匀。
分装到容器中，灭菌。
储存于2-8℃
pH7.2磷酸缓冲液——将储存缓冲液和纯化水混匀（1:
800v/v），灭菌。
PH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液
磷酸二氢钾
3.6g
磷酸氢二钠
7.2g等于0.067M的磷酸盐
氯化钠
4.3g
蛋白胨（肉或酪蛋白）
1.0g
纯化水
1000ml
在已验证过的高压灭菌锅内灭菌。
酪蛋白大豆肉汤培养基
酪蛋白胰酶消化物
17.0g
大豆粉木瓜酶消化物
3.0g
氯化钠
5.0g
磷酸二氢钾
2.5g
水合葡萄糖
2.5g
纯化水
1000ml
调节PH值至灭菌后25℃时的PH为7.3±0.2，在已验证过的高压灭菌锅内灭菌。
酪蛋白大豆琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物
15.0g
大豆粉木瓜酶消化物
5.0g
氯化钠
5.0g
琼脂
15.0g
纯化水
1000ml
调节PH值至灭菌后25℃时的PH为7.3±0.2，在已验证过的高压灭菌锅内灭菌。
沙氏葡萄糖琼脂培养基
葡萄糖
40.0g
酪蛋白胰酶消化物和动物组织胰腺消化物的混合物（1:
1）
10.0g
琼脂
15.0g
纯化水
1000ml
调节PH值至灭菌后25℃时的PH为5.6±0.2，在已验证过的高压灭菌锅内灭菌。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基
马铃薯浸液
200g
葡萄糖
20.0g
琼脂
15.0g
纯化水
1000ml
调节PH值至灭菌后25℃时的PH为5.6±0.2，在已验证过的高压灭菌锅内灭菌。
沙氏葡萄糖肉汤培养基
葡萄糖
20.0g
酪蛋白胰酶消化物和动物组织胰腺消化物的混合物（1:
1）
10.0g
纯化水
1000ml
调节PH值至灭菌后25℃时的PH为5.6±0.2，在已验证过的高压灭菌锅内灭菌。
Mossel-大肠杆菌富营养肉汤培养基
明胶胰腺消化物
10.0g
水合葡萄糖
5.0g
脱水牛胆汁
20.0g
磷酸二氢钾
2.0g
无水磷酸氢二钠
8.0g
碱性亮绿
15mg
纯化水
1000ml
调节PH值至加热后25℃时的PH为7.2±0.2，在100℃加热30min后，迅速冷却。
玫瑰红胆盐葡萄糖琼脂培养基
酵母浸出物
3.0g
明胶胰腺消化物
7.0g
胆盐
1.5g
氯化钠
5.0g
一水合葡萄糖
10.0g
琼脂
15.0g
中性红
30mg
结晶紫
2mg
纯化水
1000ml
调节PH值至加热后25℃时的PH为7.4±0.2，加热煮沸;不能再灭菌锅内加热。
麦康凯肉汤培养基
明胶胰腺消化物
20.0g
水合乳糖
10.0g
脱水牛胆汁
5.0g
溴甲酚紫
10mg
纯化水
1000ml
调节PH值至灭菌后25℃时的PH为7.3±0.2，在已验证过的高压灭菌锅内灭菌。
麦康凯琼脂培养基
明胶胰腺消化物
17.0g
蛋白胨（肉或酪蛋白）
3.0g
水合乳糖
10.0g
氯化钠
5.0g
胆盐
1.5g
琼脂
13.5g
中性红
30.0mg
结晶紫
1mg
纯化水
1000ml
调节PH值至灭菌后25℃时的PH为7.1±0.2，不断振荡并加热煮沸1min，在已验证过的高压灭菌锅内灭菌。
RappaportVassiliadis富营养培养基
大豆胨
4.5g
六水合氯化镁
29.0g
氯化钠
8.0g
磷酸二钾
0.4g
磷酸二氢钾
0.6g
品绿
0.036g
纯化水
1000ml
溶解，保温。
在已验证过的高压灭菌锅内灭菌，温度不能超过115℃，PH值在加热和灭菌后25℃时为5.2±0.5。
.
木糖，赖氨酸，脱氧胆酸琼脂培养基
木糖
3.5g
L-赖氨酸
5.0g
水合乳糖
7.5g
蔗糖
7.5g
氯化钠
5.0g
酵母提取物
3.0g
酚红
80mg
琼脂
13.5g
脱氧胆酸钠
2.5g
硫代硫酸钠
6.8g
枸橼酸铁铵
0.8g
纯化水
1000ml
调节PH值至灭菌后25℃时的为7.4±0.2。
加热至沸腾，冷却到50度倒入培养皿内。
不能在高压灭菌器加热。
溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基
明胶胰腺消化物
20.0g
氯化镁
1.4g
硫酸钾
10.0g
溴化十六烷基三甲胺
0.3g
琼脂
13.6g
纯化水
1000ml
甘油
10.0ml
加热至沸腾1分钟并振荡，调节PH值至灭菌后25℃时可达7.2±0.2。
在已验证过的高压灭菌锅内灭菌。
甘露醇盐琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物
5.0g
动物组织胰腺消化物的混合物
5.0g
牛肉浸出粉
1.0g
D-甘露醇
10.0g
氯化钠
75.0g
琼脂
15.0g
酚红
0.025g
纯化水
1000ml
加热至沸腾1分钟并振荡，调节PH值至灭菌后25℃时可达7.4±0.2。
在已验证过的高压灭菌锅内灭菌。
梭菌富营养培养基
牛肉提取物
10.0g
蛋白胨（肉或酪蛋白）
10.0g
酵母提取物
3.0g
可溶性淀粉
1.0g
水合葡萄糖
5.0g
盐酸半胱氨酸
0.5g
氯化钠
5.0g
乙酸钠
3.0g
琼脂
0.5g
纯化水
1000ml
加热溶解，煮沸，并不断搅拌。
必要时，调节PH至灭菌后25℃时可达6.8±0.2，在已验证过的高压灭菌锅内灭菌。
哥伦比亚琼脂培养基
酪蛋白胰腺消化物10.0g
肉消化物5.0g
心脏胰腺消化物3.0g
酵母提取物5.0g
玉米淀粉1.0g
氯化钠5.0g
琼脂，根据凝胶性）10.0-15.0g
纯化水1000ml
加热溶解，煮沸，并不断搅拌。
必要时，调节PH至灭菌后25℃时达7.3±0.2，用已验证过的高压锅将其灭菌。
冷却至45-50℃。
必要时，加入相当于20mg庆大霉素的硫酸庆大霉素，然后倒平皿。
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