水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测.docx
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水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测
（1）
录入时间:
2010-9-2511:
17:
29来源：
生物信息网
（一）实验目的
（1）了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
（2）学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
（3）学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
（二）实验原理
水是微生物广泛分布的天然环境。
各种天然水中常含有一定数量的微生物。
水中微生物的主要来源有：
水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。
水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落（colony-formingunit，cfu）数，故其单位应是cfu/g（mL）。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数（MPN）表示。
在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。
这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
（三）实验器材
（1）菌落总数的测定：
1）培养基：
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2）器材：
灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
（2）大肠菌群的测定；
1）培养基：
①乳糖胆盐蛋白胨培养基：
蛋白胨20g，猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g，乳糖10g，%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，。
制法：
将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，l15℃灭菌15min。
双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：
除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。
②伊红美蓝琼脂培养基：
蛋白胨10g，乳糖10g，K2HP042g，2％伊红水溶液20Ml，％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，。
制法：
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
③乳糖发酵管：
除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。
2）器材：
灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
四）实验方法
（1）水样的采集：
1）自来水：
先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
2）池水、河水、湖水等地面水源水：
在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。
如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。
（2）细菌总数的测定：
1）水样稀释及培养：
①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：
⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度（饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:
10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:
10、1:
100、1:
1000三种稀释度；污染水—被选择1:
100、1:
1000、1:
10000三种稀释度），吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。
③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。
④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
2）计算方法：
作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。
3）计数的报告：
①平板菌落数的选择：
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。
如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。
若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。
②稀释度的选择：
a.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之（表1例1）。
b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。
若其比值小于2，应报告其平均数；若比值大于2，则报告其中较小的数字（l例2、例3）。
c．若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（l例4）。
d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（1例5）。
e.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6）。
f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之（表l例7）。
③细菌总数的报告：
细菌的菌落数在l00以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。
为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。
（3）大肠菌群的测定（多管发酵法）：
表1稀释度的选择及细菌数报告方式
稀释度及菌落数
两稀释度之比
菌落总数/（cfu/g或cfu/mL）
报告方式（菌落总数）/（cfu/mL或cfu/g）
10-1
10-2
10-3
1
多不可计
164
20
-
16400
16000或×104
2
多不可计
295
46
37750
38000或×104
3
多不可计
271
60
27100
27000或×104
4
多不可计
多不可计
313
-
313000
310000或×105
5
27
11
5
-
270
270或
6
0
0
0
-
＜10
＜10
7
多不可计
305
12
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测
（2）
录入时间:
2010-9-2511:
22:
11来源：
生物信息网
1）生活饮用水或食品生产用水的检验：
①初步发酵试验：
在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液（可称为三倍乳糖胆盐）的三角瓶中（内有倒置杜氏小管），以无菌操作各加水样100mL。
在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中（内有倒置小管），以无菌操作各加入水样10mL。
如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样。
摇匀后，37℃培养24h。
②平板分离：
经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMB培养基）上，37℃培养18—24h。
大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
③复发酵试验：
将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37℃培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。
④报告：
根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表2（或表3），报告每升水样中的大肠菌群数（MPN）。
2）水源水的检验：
用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。
①严重污染水：
1，0．1，0．01．0．00lmL各1份。
②中度污染水：
10．1，0．1，0．01mL各1份。
③轻度污染水：
100，10，1，0．1mL各l份。
④大肠菌群变异不大的水源水：
10mLl0份。
表2大肠菌群检索表（饮用水）
0
1
2
备注
每升水样中大肠菌群数
0
＜3
4
11
接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）
1
3
8
18
2
7
13
27
3
11
18
38
4
14
24
52
5
18
30
70
6
22
36
92
7
27
43
120
8
31
51
161
9
36
60
230
10
40
69
＞230
表3大肠菌群数变异不大的饮用水
阳性管数
0
1
2
3
接种水样总量300mL（3份100mL）
每升水样中大肠菌群数
＜3
4
11
＞18
表4大肠菌群检索表（严重污染水）
接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
备注
1
-
-
-
-
＜900
接种水样总量为（1，，，各一份）
-
-
-
+
900
-
-
+
-
900
-
+
-
-
950
-
-
+
+
1800
-
+
-
+
1900
-
+
+
-
2200
+
-
-
-
2300
-
+
+
+
2800
+
-
-
+
9200
+
-
+
-
9400
+
-
+
+
18000
+
+
-
-
23000
+
+
-
+
96000
+
+
+
-
238000
+
+
+
+
＞238000
表5大肠菌群检索表（中度污染水）
接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
备注
10
1
-
-
-
-
＜90
接种水样总量为（10，1，，mL各一份）
-
-
-
+
90
-
-
+
-
90
-
+
-
-
95
-
-
+
+
180
-
+
-
+
190
-
+
+
-
220
+
-
-
-
230
-
+
+
+
280
+
-
-
+
920
+
-
+
-
940
+
-
+
+
1800
+
+
-
-
2300
+
+
-
+
9600
+
+
+
-
23800
+
+
+
+
＞23800
表6大肠菌群检索表（轻度污染水）
接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
备注
100
10
1
-
-
-
-
＜9
接种水样总量为（100，10，1，各一份）
-
-
-
+
9
-
-
+
-
9
-
+
-
-
-
-
+
+
18
-
+
-
+
19
-
+
+
-
22
+
-
-
-
23
-
+
+
+
28
+
-
-
+
92
+
-
+
-
94
+
-
+
+
180
+
+
-
-
230
+
+
-
+
960
+
+
+
-
2380
+
+
+
+
＞2380
表7大肠菌群变异不大的水源水
阳性管数
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
每升水样中大肠菌群数
＜10
11
22
36
51
69
92
120
160
230
＞230
备注
接种水样总量100mL（10mL10份）
操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。
同时应注意，接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管；接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管（瓶）中的总液体量为单倍培养液量。
然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查表4、表5、表6或表7，报告每升水样中的大肠菌群数（MPN）。
附：
滤膜法
滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。
将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。
再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群数（MPN）。
（1）准备工作：
1）滤膜灭菌：
将3号滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。
前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。
2）滤器灭菌：
准备容量为500mL的滤器，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用121℃高压灭菌20min。
3）培养：
将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。
（2）过滤水样：
1）用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。
水样摇匀后，取333mL注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在—50kPa压力下进行抽滤。
2）水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，两者间不得留有间隙或气泡。
若有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37℃培养箱内培养16-18h。
（3）结果判定：
1）挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。
①紫红色，具有金属光泽的菌落。
②深红色，不带或略带金属光泽的菌落。
③淡红色，中心颜色较深的菌落。
2）凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基，37℃培养6-8h，产气者，则判定为大肠菌群阳性。
3）1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3。
食品中细菌总数的测定
录入时间:
2010-9-2511:
26:
31来源：
生物信息网
一、目的与要求：
1 学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理
2 了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义
二、原理：
菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。
菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
三、 材料
1 食品检样
2 培养基
营养琼脂培养基，无菌生理盐水
3 其它
无菌培养皿，无菌移液管，无菌不锈钢勺。
四、流程、步骤
1 取样、稀释和培养
A 以无菌操作取检样25g（或ml），放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1:
10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理1min，制成1:
10的均匀稀释液。
B 用1ml灭菌吸管吸取1:
10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1:
100的稀释液。
C 另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支10ml吸管。
D 根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
E 稀释液移入平皿后，将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。
同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。
F 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。
2 菌落计数方法
作平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。
到达规定培养时间，应立即计数。
如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不要超过24h。
3 菌落计数报告方法
A 平皿菌落数的选择
选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准。
每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。
B 稀释度的选择
a 应选取平均菌落数在30～300之间的稀释度报告。
b 若有二个稀释度均在30～300之间时，应以二者比值决定，比值≤2取平均数，比值>2则其较小数字。
c 若所有稀释度均>300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
d若所有稀释度均<30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。
e若所有稀释度均无菌落生长，则应按<1乘以最低稀释倍数报告之。
f若所有稀释度均不在30～300之间，有的>300，有的又<30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
C 菌落计数报告方法
菌落数在1～100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。
五、 结果
1 将实验测出的样品数据以报表方式报告结果。
2 对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。
希瓦菌生物学特性的实验研究
录入时间:
2010-9-2511:
30:
31来源：
中国人兽共患病学报
基因分型技术的快速发展，为更准确地进行微生物学分类、临床快速鉴定细菌感染、了解病原菌的致病机制以及它们与宿主的关系提供了可能。
本文所阐述的希瓦菌属（Shewanella spp．）的分类，就是随着全基因测序研究而不断趋于完善的。
该菌的命名曾经历了原本归属于无色棒菌属（Achromobacter spp．）、假单胞菌属（Pseudomonas spp．）、异单胞菌属（Alteromonasspp．）也称交替单胞菌属（Rubescens spp．）、腐败假单胞菌（Pseudomonas putrefaciens）几个阶段，最终命名为希瓦菌属（Shewanella spp.）。
1998年Shideh根据5SrRNA序列的同源性研究，对希瓦菌属进一步做了种、型的分类。
本文主要参照Shideh等报道的分类原则和方法，对分离来自腹泻病人粪便和外环境的13株希瓦菌，进行了生物学特性的实验研究，现将结果报告如下。
1材料与方法
实验菌株 5株分离自腹泻病人的粪便，1株分离自病家附近的池塘水，1株分离自病人家苍蝇，6株分离自病家饲养的禽、畜粪便（其中猪粪2株、羊粪3株、鸡粪1株），共计13株。
分离培养基 腹泻病人的菌株直接由麦康凯平板分离。
池塘水经EC肉汤增菌后，由麦康凯平板分离。
苍蝇和禽、畜粪便经含新生霉素的mEC肉汤36℃震荡培养6h，分离于CT—SMAC（头孢克肟、亚碲酸钾山梨醇麦康凯）平板。
希瓦菌属的鉴定 用bioMerieux公司的ATB半自动细菌鉴定仪-ID32 GN和Api20E及Api 20NE试条根据说明书进行鉴定。
1.4 腐败希瓦菌（Shewanella putrefaciens，SP）和海藻希瓦菌（Shewanella algae，SA）的鉴别用Hugh—Leifson O／F试验培养基，以观察其对糖、醇氧化分解的能力及在％的盐胨水中和SS琼脂的生长情况和绵羊血琼脂上是否有溶血现象进行属内区分。
培养基购自市售的干燥培养基。
2 结 果
菌体形态 13株希瓦菌，均为革兰阴性，无芽孢，直杆状或微弯曲的杆菌，大部分单个或偶有
短链状排列。
生物学特性 该菌为需氧菌，糖代谢类型为氧化型。
对营养要求不高，在肉汤培养基中，经36℃培养3～6h呈均匀混浊，18~24h液面形成菌膜，继续延长时间后，则管底形成膜状物沉淀。
在的碱性胨水中生长良好。
在半固体琼脂中显示有动力，表层菌苔呈淡粉红色，但色素不扩散，也不溶于乙醇及氯仿等有机溶剂。
在KIA琼脂中产生大量的硫化氢。
在麦康凯琼脂上，形成无色半透明光滑、淡橙色菌落。
在CT—SMAC琼脂上形成无色半透明中心略带淡灰色的菌落。
在SS琼脂上部分菌株被抑制，在绵羊血琼脂平板上大部分菌落不溶血。
生化鉴定结果 根据美国CDC的生物学分类原则，并通过用传统的鉴定方法对13株不同来源的希瓦菌的生物学实验研究，结果其中9株为腐败希瓦菌，4株为海藻希瓦菌，详见表1。
使用微生物鉴定系统：
ATB-Expression的ID32GN试条及API20NE和20E同步进行鉴定，其鉴定结果均为腐败希瓦菌，符合率分别为～%，不能区分希瓦菌的不同种别。
生物分型 在9株腐败希瓦菌中，生物1型6株，其特性为能氧化分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，其中还有3株能分解阿拉伯糖，2株分解木糖。
在SS琼脂和%氯化钠胨水中均不生长，在血琼脂平板上不溶血。
生物2型3株，突出特征是除能缓慢氧化分解葡萄糖和产生尿素酶外，对其他几种试验的糖类和醇类均不能氧化分解，但是它们都能在SS琼脂上生长、在%氯化钠胨水中不生长，并有部分菌株能利用枸橼酸盐和丙二酸盐，在血平板上不溶血。
4株海藻希瓦菌的鉴定结果显示，除能微弱氧化葡萄糖、果糖和核糖外，对其它几种糖、醇均不能氧化，而在SS琼脂和%氯化钠胨水中均能生长，并能在血琼脂平板上缓慢出现溶血现象。
表1 13株希瓦菌的生化试验结果
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