侦测食品中之微生物.docx
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侦测食品中之微生物
DetectingMOinFoods
Aims
1.Tounderstandthetraditionalmethodsandrapidmethodsfordetectingmicroorganismsinfoods
2.Tounderstandtheprinciples,advantages,limits,andapplicationforeachdetectingmethod
3.Tounderstandtheissuesofthemetabolicallyinjuredmicroorganisms(MO)andtheviablebutnon-cultivableMO(VBNC)
Outline
1.Homogenizationmethods
2.Standardplatecount(SPC)
3.Spiralplatecount
4.Membranefiltrationmethods
5.Microscopeplatecount
6.Petrifilm
7.MPN
8.Directmicroscopiccount
9.Dyereductiontest
10.DetectingMOonsurfaces
11.Metabolicallyinjuredmicroorganisms
12.Viablebutnon-cultivablemicroorganisms(VBNC)
13.Phisical,chemical,molecular,andimmunologicalmethods
§均質法(Homogenizationmethods)
WaringBlendorvs.Stomacher
WaringBlendor為廣泛使用方法(除了有刺、尖銳之食品外),
優點:
1.免於清洗、殺菌操作
2.正常操作時間內(≦2min)不生熱,不影響菌數
3.噪音低
4.均質液易貯藏
5.不會引起食品組織(細胞)之高度破碎,容易吸取樣品,而且,降低來自食品組成份之干擾(尤其在非SPC偵測法)
9-1
§標準平板法〔StandardPlateCount(SPC)〕,活菌數
1.計數:
25~250cfu(或30~300cfu)
2.假設:
(1)各培養皿中之菌落源自單一菌體。
(2)所提供之條件(營養、溫度等)足以使食物中所有菌生長,而產生菌落。
3.方法:
(1)混稀法(pourplatecount)
(2)塗抹法(spreadplatecount,surfaceplatecount)
塗抹法優缺點(與混稀法比較)
(a)無熱傷害
(b)有利好氧菌快速生長
(c)容易計數
(d)可自動化操作
(e)菌落易分離
§螺旋平板法(Spiralplatecount)
1.所用培養基、平板、稀釋液、吸管均較少
2.快速,50~60plate/h
3.易受食物顆粒阻塞
5.設備費用高
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§膜濾法(Membranefiltrationmethods)
●適用於水、飲料、或空氣等菌數低者
●可能需預濾,以去除食物顆粒,或添加酵素、介面活性劑等以利過濾
1.直接螢光過濾法(DirectEpifluorescentFilterTechnique,DEFT)
留於濾膜上之菌株,以螢光染劑,如acridineorange染色,再以螢光顯微鏡計數
操作:
Foodhomogenate
↓
5μmnylonfilter
↓
filtrate,+2mlTritonX-100&0.5mlTrypsin
↓
0.6μmNucleoporepolycarbonatefilter
↓
filterstainedwithacrineorange
↓
count
2.Microcolony-DEFT
●
Filtration
Microcolonymethod:
Sample→filter→plate,incubatefor3~6h→microscopiccount
●Microcolony-DEFTmethod:
(nucleoporemembrane)
Sample→filter→plate,andincubated→acridineorangestain→fluorescencemicroscopiccount
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3.疏水性格膜過濾法(HydrophobicGridMembraneFiltration,HGMF)
(1)1600waxgrid/membrane
(2)減少稀釋操作
(3)已有分析項目
totalcoliforms
fecalcoliforms
Salmonellae
E.coliO157:
H7
§顯微鏡菌落計數(Microscopecolonycounts)
0.1mlsample+2mlnutrientagar→mix→spreadovera4cm2areaonaglassslide→incubated3~8hinawarmmoistchamber→airdried,flame-fixed,stainforcountwithmicroscope.
§Petrifilm
1.將培養基塗敷於數層纖維所構成之薄膜上
2.攜帶儲存方便
3.可用於表面微生物分析
§最可能菌數法〔MostProbableNumber(MPN)〕,活菌數
1.3-tubeor5-tube
2.atleast3seriousdilutionsareused
3.monitoredbyturbidity,colorchange,orgasproduction
4.estimateddata,lessprecisethanagarplatingmethods
5.usedforlowcellcounts
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§染劑還原法(DyeReductionTests),活菌數
1.原理:
菌體具reductase,當菌體代謝時,故使培養液還原所需時間與菌數成反比。
2.還原指示劑:
methyleneblue:
從藍色變成無色
resazurin:
二段式,
(1)從藍→紫→粉紅,不因O2存在而又變成藍;
(2)從粉紅變無色,可因O2存在又氧化成粉紅。
3.特性
(1)比SPC快
(2)估測值
(3)非所有MO.還原能力(速度)相同
(4)指示劑可能對部分MO.有抑制作用
(5)食品本身可能亦含還原劑或酵素而干擾
§直接鏡檢〔DirectMicroscopicCounts(DMC)〕,活、死菌
1.操作
(1)取0.01ml均質液平均塗抹於1cm2面積之載玻片上
(2)固定(40-50℃)、乾燥
(3)染色
(4)油鏡下計數
2.優點
(1)快速;
(2)簡單;(3)不需其他設備;(4)觀看菌體形狀;(5)樣品量極少。
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3.缺點
(1)死、活不分;
(2)僅適用於高菌含量樣品;(3)觀察者易疲勞;(4)菌體可能成團,分散不均,或有些不易染色。
現已有方法區分死、活菌體
ØHowardMoldCount
1911年由B.J.Howard開發,分析蕃茄製品中黴菌,另外,機械黴Geotrichumcandidum亦相似,均利用有凹槽載玻片,在顯微鏡下,計數食品中所含黴菌菌絲,需有經驗者方能操作,且易疲勞。
§表面微生物檢驗
生物體表
加工機械、器皿、工作台
1.Swab/Swab-RinseMethod
最早、最廣泛使用者
以棉花棒(濕)塗抹固定面積之物體表面,再將之放入含無菌水之試管內,均質,稀釋,平板法計數,若配合ATP分析法,塗抹後,可迅速得知結果,常用於清洗效果之評估用。
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2.接觸平板法(Contactplate)
以特殊雙重皿,導入15.5-16.5ml之培養基,產生凸起洋菜培養基表面,將之覆蓋於欲測物面,加蓋培養,計數菌落數。
回收率不高,有人云僅0.1%,即若測得10cfu/cm2,實際含量為104cfu/cm2。
亦有人實驗顯示回收率低於塗抹法(Swabmethod),較適用於低污染物表面。
3.噴槍法(Spraygun)
以高壓水沖洗物體表面,再分析洗液中菌數。
對肉品表面菌數分析,此法優於塗抹法。
§代謝性受傷之微生物(Metabolicallyinjuredorganisms)
微生物受次死環境侵害,影響其代謝(但未死亡),故在選擇性培養基上無法生長,但可在非選擇性培養基生長,故可將樣品分別選擇性及非選擇性培養基分析之,二者之差,即為InjuredMO.。
食品病原菌之檢測管制,常為「不得檢出」,測試樣品由於曾經凍藏、或加熱等處理,可能含有受傷之病原菌(未死),故通常需將樣品均質液放在適當非選擇性培養液中短暫時間(1~4h),使受傷菌復原,再以選擇性培養基分析之。
由部分研究顯示,培養液中含丙酮酸或催化等有助於受傷菌復原,此二物質之功能均為分解過氧化物,故推測受傷菌可能缺乏去除過氧化物之能力。
MO.代謝性傷害可能發生在細胞膜(脂質)、核醣體、DNA、或某些酵素。
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§不能培養的活菌(Viablebutnon-cultivableorganisms,VBNC)
VBNC與代謝傷害性菌不同,後者可於非選擇性培養基修護。
VBNC首被發現於海洋弧菌,當海水溫度被降至5℃,弧菌成為VBNC狀態。
此時,platecount者很低,但由以acridineorange之鏡檢法(可區分死、活),菌數卻非常高。
當溫度升高,VBNC即可恢復原來狀態,處於VBNC之病菌,仍具致病力,僅毒性較低。
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§物理、化學、分子及免疫分析法
A.物理方法
1.電阻抗或導電度法(Impedance/ConductanceMethod)
(1)原理:
微生物生長時,要利用(分解)環境中成份,因此改變環境(培養液)中電阻抗/導電度。
(2)固定儀器,有其偵測之靈敏度。
(3)儀器感應出電阻抗/導電度變化所需時間(Detectiontime)與菌體數成反比。
(4)由已知菌數樣品進行標準曲線之制訂,再用以分析未知菌數。
(5)Vitek公司之Bactometer測電阻抗;Malthus公司則偵測導電度。
2.流電細胞計數法(flowcytometry)
原用魚動物細胞測定,現可用於酵母菌計數,若配合螢光抗體,可測特定細菌。
B.化學方法
1.Thermostablenuclease
(1)金黃葡萄球菌具coagulase及therostablenuclease,二者相關性高,故藉由食品中Thermostablenuclease活性高低,得知S.aureus多少。
然部分enterococcus亦具nuclease活性,且少部分為thernostablenuclease(4.3%)。
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(2)分析thermostablenuclease以代表S.aureus生長狀況之優點:
(a)耐熱性,即使菌體因熱死亡,nuclease仍在,而S.aureus所產之腸毒素亦屬熱安定性。
(b)偵測比腸毒素快。
(c)比腸毒素早產生。
(d)不需濃縮即可偵測,腸毒素需濃縮。
(e)二者均為熱安定性。
2.Limuluslysateforendotoxins
G(-)之outermembrane之lipopolysaccharide(LPS)—endotoxin
Limuluspolyphemous之amoebocyte(血球細胞)裂解物蛋白對endotoxin極敏感(活化),使得lysate呈膠狀,早期分析法乃偵測可使lysate成gel之最大食品稀釋度(即為力價數,titer),為半定量法。
近來,發展出呈色法,加入試劑(如gly(ala)-arg-ρ-nitroalanine(ρNA),當樣品中有LPS,可使coagulase活化,其可將ρNA水解,產生ρ-nitroalanine,測405nm吸光值。
Endotoxin
FactorCFactorC*
FactorBFactorB*
ProclottingenzymeClottingenzyme
*:
活化狀態
CoagulogenCoagulin
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ρNA:
ρ-nitroalanine
3.ATP測定
活細胞均有ATP且細胞內ATP含量恆定,以菌量而言,含量約10-18~10-17mole/cell,將菌體內之ATP萃取出來,分析其ATP含量,即間接代表菌數多寡。
利用螢火蟲發光機制,來分析ATP:
LH2+E+ATPE·LH2-AMP+PPi
E·LH2-AMP+O2E+L=O+CO2+AMP+Light
LH2:
luciferinE:
luciferase
L=O:
oxyluciferinPPi:
pyrophosphate
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此法非常快速,可用在工廠清洗效率評估之快速偵測用。
若應用在食品上,需克服來自食品之ATP干擾,可利用離心、過濾等物理方除去食品顆粒,或添加酵素apyrase,選擇性地破壞食品ATP。
4.螢光性及發光性基質之應用
常用基質:
4-methlumbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG)
4-methlumbelliferyl-β-D-galactoside(MUGal)
4-bromo-4-chloro-3-Indolyl-β-D-glucuronide(X-Gluc)
o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)
5-bromo-4-chloro-3-Indoxyl-β-D-glucuronide(BCIG)
L-alanine-P-nitroanilied(LAPN)
其中以MUG之螢光性基質最常用,其可被β-D-glucuronidase(GUD)水解,釋放出具螢光之4-methyl-umbelliferygroup,E.coli具有GUD,故可用於E.coli檢驗,將MUG加入大腸桿菌群分析用之選擇性培養基中,如lauryltryptosebroth(LTB),有E.coli者,會產生螢光,約107cell之E.coli產生之GUD才足夠偵測到MUG結果。
ONPG亦同樣利用,經β-D-galactosidase水解後,產生黃色(420nm吸光),用已偵測Coliforms。
若NPG及MUG同時當作唯一營養基質,coliforms呈黃色菌落,黃色菌落同時有螢光者為E.coli。
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5.Lux基因之發光
Lux基因負責luciferase之合成,將luxgene轉殖到噬菌體,在噬菌體本身,因缺發光所需之成分,無法發光,利用噬菌體對細菌記主之專一性,其基因進入細菌後,發光。
可用以分析特定細菌(病原菌)。
C核酸探針/PCR
尋找預測微生物特有的核酸片段,將之標示,此即為核酸探針。
當此probe碰到與其互補序列,會結合(or雜交,hybridization),由probe之標示物,我們可偵測之。
典型分析法:
預測cell→抽取DNA→內切水解→電泳→轉至NCmembrane→加probe行hybridization→清洗→偵測,偵測敏感度:
104~105,若低於此,樣品先經enrichment,使少量菌增殖,再偵測之。
另外,發展菌落雜交法(colonyhybridization),乃樣品均質→選擇性培養基培養,其上菌落複製至membrane上,在加reagent,使菌溶製(lysis),使DNA露出,成單股,加probe偵測之。
近年來,伴隨PCR(polymerasechainreaction)之放大技術,使食品中存在之少數菌之DNA,在人為操控環境下進行複製。
Primer,DNApolymerase,dATP,dGTP,dCTP,dGTP
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經過多次循環(20~50cycles),可使單一DNA分子擴增至107DNA分子,如此,樣品中即使僅1個cell,也可以測到。
1.核酸探針的優點和缺點
(1)核酸探針的優點:
(a)核酸探針不必單離、純化菌株,可節省不少的時間與成本。
(b)核酸探針可以快速鑑定、計數與之雜交的菌株。
(c)特異性高,其受微生物其基因突變或細胞內的控制影響較少。
(d)對於有機溶劑、鹽的容忍度而言,DNA的穩定度比蛋白質為高。
(e)靈敏度高。
(2)核酸探針的缺點:
(a)利用32P-labeled核酸探針,其t1/2=14天
(b)核酸探針不能探知食品中已經存在的毒素。
(3)核酸探針的一般特性:
(a)Targetnucleicacid的選擇(Wolcott,1991)
選擇Targetnucleicacid可由下列四方面著手:
(i)為genomicDNA,物種會含隨某些特殊的基因片段,故其特異性甚高。
(ii)為messengerRNA(mRNA),在生物體內mRNA的量比genomicDNA高出很多,所以比較容易被偵測。
(iii)為rRNA,這是最有用的核酸探針來源,它同時具有用genomicDNA和mRNA為探針的點。
最後核酸探針的來可由plasmidDNA所獲得,菌產生毒素的基因可能在plasmidDNA上,故可藉此作核酸探針。
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(b)探針的大小
探針的大小可從10nucleotidebases(M.W.3,300)至10,000base(M.W.3,300,000),然而最常見的核酸探針在14至40base之間。
核酸探針可依其核酸探針的片段長度區分成短鏈探針和長鏈探針。
短鏈探針,其雜交的度比較快,但是專一性較差且很難被label上去。
(c)核酸探針的label
核酸探針label的方法計有(Veldetal.,1988)
a.radioactiveprobe
b.biotin-avidinsystem
c.mercurationofnucleicacidprobe
d.chemicalmodificationofDNAprobe
e.detectionofUV-radiatedDNAbysepificantibody
f.sulfonatedDNAprobe
D.免疫分析
利用抗體-抗原專一性結合特性,偵測細菌、毒素或其他污染物。
抗體-抗原結合之偵測:
(1)標示法
●螢光免疫分析—需螢光顯微鏡或螢光分光光度計
●放射性免疫分析—較昂貴,且有安全及半衰期問題
●酵素免疫分析—廣泛使用,有多種分析模式
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(2)沈澱法
抗體有2個抗原結合位置,而抗原若為大分子者,常可與多個抗體分子結合,如此,多個抗體、抗原分子結合成大分子而不可溶,沈澱之。
免疫擴散分析即屬此。
免疫雙擴散分析(Ouchterlonytest)
(3)凝集法
將抗體(或抗原)coating在微小顆粒表面,用已偵測抗原(或抗體),當與被偵測物質結合,造成微小顆粒產生凝集現象。
所用微小顆粒,早期使用紅血球,但易破,現採用latexbead。
由於免疫分析法其靈敏度之限制(103~105),菌數太低者,需經enrichment,使菌體增殖,在加抗體分析之。
另外,抗體專一程度,為關鍵所在,否則易有交叉反應。
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目前在食品系統,以EIA及Latexbead之凝集法,最廣泛被使用,而Oxoid所發展出之Salmonella1-2Test,屬於免疫沈澱分析法。
食品均質液,若含Salmonella,其可在其內生長、游動(含鞭毛),由至非選擇性培養管內,而後者加入Salmonella之鞭毛抗體,碰到Salmonella鞭毛抗原,產生沈澱帶。
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9-18
9-19
9-20
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HGMF
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