医学微生物学实验报告.docx
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微生物实验报告
题目
脓汁和粪便标本中病原菌的检测
成绩
年级专业
实验者
学号
组号
小组成员
指导老师
一、实验目的
1. 了解细菌生长的基本营养条件以及培养基的种类。
2. 掌握培养基制备的原则和一般方法。
3. 掌握无菌操作技术。
4. 掌握病原菌的分离与培养方法。
5. 掌握油镜的正确使用。
6. 掌握细菌涂片标本的制备以及革兰氏染色法。
7. 熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。
8. 掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。
9.掌握纸片扩散法检测药物敏感性原理及应用。
10.掌握玻片凝集试验的原理方法、方法、结果观察与判断。
二、实验器材
1．药品与试剂：
营养琼脂粉、营养肉汤粉、半固体琼脂粉、蒸馏水、脓汁标本、粪便标本、普通营养琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、斜面培养基管、液体培养基管、半固体培养基管、结晶紫染液（第1液）、卢戈氏碘液（第2液）、95%酒精（第3液）、稀释石炭酸复红（第4液）、香柏油、二甲苯、葡萄糖发酵微量管、乳糖发酵微量管、兔血浆、生理盐水、诊断血清、Muller-Hinton琼脂平板、青霉素滤纸片、链霉素滤纸片、庆大霉素滤纸片
2.器材：
1500W电炉、天平、称量纸、药勺、三角烧瓶、量筒、试管、刻度吸管、洗耳球、棉塞、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、试管筐、尺、平皿、酒精灯、电炉、接种环、接种针、染色架、吸水纸、擦镜纸、打火机、笔、显微镜、小砂轮、载玻片、镊子、试管刷、冰箱、恒温培养箱
三、方法与步骤
1、培养基的制备：
培养基
称量干粉培养基（g）
水量（ml）
煮沸（次）
分装（ml）
备注
营养琼脂
11.4
300
2瓶，500ml锥形瓶，平板
营养琼脂
2.9
75
3
5
15支，中试管，斜面
营养肉汤
1.1
50
1
1
15支小试管，液体
半固体琼脂
1.7
60
3
3
15支，小试管，高层
干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸、牛皮纸，用橡皮筋扎好→放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到髙压蒸汽灭菌室→灭菌（用于倒平板的培养基不用加热溶解，摇匀即可）
2、细菌的分离培养
平板划线分离法
甲→脓汁标本→营养琼脂平板（黄色）乙→脓汁标本→营养琼脂平板（黄色）
丙一粪便标本一伊红美蓝平板（紫色）丁一粪便标本一伊红美蓝平板（紫色）
方法：
（1）右手拿接种环（如握笔式），烧灼灭菌，欲伸入试管内的接种环杆部分亦要迅速通过火焰2~3次，以杀灭其表面细菌；
（2）左手握住盛有标本的试管的下端，右手以无名指、小指与手掌在火焰旁拔出试管棉塞并挟住之，将管口迅速通过火焰三次灭菌；（3）立即将已灭冷却的接种环伸入试管内，沾取标本（或菌液）一环，试管口火焰灭菌后塞好棉塞;（4）左手斜持平板，略开盖，在酒精灯火焰左前方约5~6cm处，将接种环上的菌液涂抹于平板表面的边缘部分；（5）烧灼接种环，冷却后，从原涂抹部分开始，连续平行划线，每次只划平板的1/4~1/5，划毕后接种环再经火焰灭菌，冷却后用同样方法在平板其余部分划线，每次划线要与前次划线重叠1-3条，共计3^次（区）；（6）接种完毕，将接种环烧灼灭菌后方可放下；（7）将培养皿倒置，37°C培养34小时后，观察结果。
3、细菌的纯培养
斜面接种分工
甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面乙→普通平板→白色菌落→1支斜面
丙→EMB平板→紫黑菌落→1支斜面丁→EMB平板→粉红菌落→1支斜面
方法：
接种环→套住菌落→轻刮取菌→接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉→条细菌接种线→再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线→细菌涂布接种在斜面培养基的表面→斜面正面上2/3作标记：
组号、颜色→收集平板-灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。
4、细菌的形态学检查
涂片→干燥→固定→染色
（1）涂片→干燥→固定
甲→黄色，紫黑。
乙→白色，粉红。
丙→黄色，紫黑。
丁→白色，粉红。
方法：
涂片：
①接种环取盐水3ulX2滴，水滴间距小于2cm;②取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混勻，涂成大于lcm2;③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。
→干燥→固定：
手持载玻片→端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2〜3秒钟。
（2）革兰染色
涂片→干燥→固定→结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95%乙醇→脱色约20秒钟—7尺洗—稀释品红—复染1分钟—水洗—吸干，镜检。
油镜使用方法：
10X物镜—看清标本—滴加香柏油—100X油镜—浸泡油中→模糊物象→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油—擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:
3）混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。
5、液体培养基接种（肉汤接种）
甲→黄色，乙→白色，
丙→紫黑，丁→粉红。
方法：
（1）接种环斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接种；
（2）在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。
退出接种环，烧灼灭菌；（3）标记：
组号，颜色
6、细菌的生化试验等
a.细菌的糖发酵试验
甲—紫黑菌苔—①葡萄糖乙—紫黑菌苔—②乳糖
丙→粉红菌苔→③葡萄糖丁→粉红菌苔→④乳糖
方法：
①用砂轮在糖发酵管液面上方2〜3cm处切割，然后，向切口外侧分离掰断，管口烧灼灭菌。
②接种针斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。
③退出接种针，烧灼灭菌。
④管口朝向相同，放置在平皿内。
b.抗菌素敏感性试验
纸片扩散法
甲→黄色菌液乙→白色菌液
丙→紫黑菌液丁→粉红菌液
方法：
①先取→环菌液；②沿平板直径拉一条细菌接种线；③再取一环菌液；④旋转平板90度角，拉另一条接种线，使两条细菌接种线呈“十字形”；⑤然后在平板上半部，作连续来回密集划线，每次划二分之一平板；⑥旋转平板90度角，二次密集划线；⑦旋转平板90度角，三次密集划线；⑧旋转平板90度角，四次密集划线；⑨设三点，呈等边三角距离；⑩点距离平板边缘约15mm;⑪作标记：
青、先、庆；⑫镊子尖嘴朝下，夹取相应药物纸片的边缘，平贴在已设定的位置上，轻轻按压纸片。
c.血浆凝固酶试验
兔血浆+黄色，白色
方法：
①取二滴兔血浆（rabbitplasma）置于洁净的玻片上。
②分别用接种环取白色和黄色菌苔（约2〜3个菌落的菌量）与血浆研磨混合成直径8〜10mm的一层薄菌膜，立即观察结果。
③菌液出现明显凝块者为阳性，否则为阴性。
d.半固体穿刺接种法
甲→白色乙→金黄色
丙→紫黑丁→粉红
方法：
①接种针斜面取菌，从半固体中心，垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针；②管口、接种针经火焰烧灼灭菌；③标记:
组号,颜色。
7、细菌的血清学试验、结果分析
玻片凝集试验
方法：
（1）取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。
远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul;
（2）用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀。
四、结果与讨论
（一）实验结果
1.洗手前后对比：
图1.1甲乙洗手前后图1.2丙丁洗手前后
空气的细菌学检查结果（实验室内，暴露在手机下）：
图1.3空气的细菌学检查结果
CFU/m3＝50000N÷AT=50000×13×（3.14×3.5cm2）×40/m3=1118/m3
2.细菌的分离培养结果：
（1）脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落，菌落的色素是脂溶性的，是细菌本身的颜色。
菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。
（2）粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落色素是水溶性的，不是细菌本身的颜色，紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落，菌落直径2〜3mm；粉红色菌落淡粉红色，半透明，直径1〜2mm.
（3）从四张平板画线的结果上来看，四张均有不足，得不到特别典型的菌落。
第一二张脓汁的营养琼脂平板，前面两区涂抹太密集，而板的其他部位未充分利用，得不到十分明显的菌落。
第三粪便的平板涂布时，用力过大划破平板，而第四张粪便的平板第一区太稀疏，未充分利用平板，故在培养后未见到数量较少的粉红菌落，原因是初次划线时，力度与划线的密度均未能很好地掌握，动作不熟练，不能连续划线。
图2.1甲，乙→脓汁标本→营养琼脂平板
图2.2丙，丁→粪便标本→伊红美蓝平板
3.细菌的纯培养：
在斜面培养基上得到四种菌体的纯培养标本，从普通平板上挑取的金黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，金黄色或白色。
从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。
菌苔灰白色、表面湿润、光滑、前者不透明，后者透明。
图3.1四种菌落在斜面培养基上生长情况
右左向右依次为金黄，白色，紫黑，粉红菌苔
4.细菌的形态学检查:
图4.1脓汁菌苔（左边为金黄色菌苔，右图为白色菌苔）
图4.2粪便菌苔（左图为紫黑色菌苔，右图为粉红菌苔）
镜下观察：
用普通平板，从浓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。
结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
用伊红美蓝平板，从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。
紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。
粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。
显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。
5、液体培养基接种
图5.1液体培养基接种结果从左至右分别为：
（①黄色细菌②白色细菌③紫黑色细菌④粉红色细菌）
6.细菌的生化试验等:
（1）半固体穿刺接种法
图6.1半固体穿刺
结果观察及讨论：
表1.动力试验结果
菌苔半固体实验
紫黑细菌1+
紫黑细菌2+
粉红细菌1-
粉红细菌2-
+：
阳性-：
阴性
1、紫黑细菌1和2细菌自接种部位向四周移动、扩散生长，培养基略微呈毛刷状或云雾状混浊状态，表明其有鞭毛。
结合其他组的结果，我们认为紫黑菌苔应当是动力阳性的。
2、粉红细菌菌苔均沿着直线生长，可看出其无鞭毛。
（2）细菌的糖发酵试验
图6.2糖发酵实验结果图.从左至右分别为：
（①紫黑→葡萄糖②紫黑→乳糖③粉红→葡萄糖④粉红→乳糖）
编号
菌苔
糖发酵管
反应现象
结果描述
符号
甲
紫黑
糖发酵管变黄色有气泡
分解X糖产酸又产气
⊕
乙
紫黑
糖发酵管变黄色有气泡
分解X糖产酸又产气
⊕
丙
粉红
糖发酵管变黄色无气泡
分解X糖产酸不产气
+
丁
粉红
④
糖发酵管仍紫色无气泡
分解X糖不产酸不产气
-
+：
产酸或阳性⊕：
产酸产气-：
阴性
紫黑细菌微型发酵关内液体变黄，产生气泡，气泡的高度分别为10mm和17mm，说明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，产酸产气；粉红细菌只分解葡萄糖，不产气，不分解乳糖。
（3）抗菌素敏感试验结果:
图6.3抗菌素敏感试验结果
表3各菌抑菌圈直径（mm）表
菌苔青霉素头孢曲松庆大霉素
金黄色354232
白色282134
紫黑—3027
粉红—3530
表4.药敏试验结果分析
青霉素头孢曲松庆大霉素
金黄色+++
白色±±+
紫黑-++
粉红-++
-：
耐药±：
中度敏感+：
敏感
金黄细菌对青霉素敏感，对头孢曲松敏感，对庆大毒素敏感
白色细菌对青霉素中度敏感，对头孢曲松中度敏感，对庆大毒素敏感
紫黑细菌对青霉素耐药，对头孢曲松敏感，对庆大毒素敏感
粉红细菌对青霉素耐药，对头孢曲松敏感，对庆大毒素敏感
（4）血浆凝固酶实验结果：
图6.4白色（左）与金黄色（右）菌苔
1、白色菌苔不发生凝块，容易涂抹。
呈均匀乳白状态。
2、黄色菌苔能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,附着于菌体表面,形成凝块，涂抹不开。
说明黄色细菌为致病菌。
7.细菌的血清学试验结果：
图6.5粉红菌苔（右）凝集结果（左侧为对照）
1、由实验结果图可看到，生理盐水一端不出现凝集，福氏志贺菌诊断血清一端菌液浑浊，少量絮状，为阳性。
说明粉红菌为福氏志贺菌。
8.结论：
肠道杆菌科各菌属生化反应鉴别表
葡萄糖
乳糖
麦芽糖
甘露醇
蔗糖
半固体
埃希菌属
⊕
⊕
⊕
⊕
√
+
志贺菌属
+
√
√
+/-
-/+
-
沙门菌属
⊕/+
-
⊕
⊕
-
+
霍乱弧菌
+
-
+
+
+
+
变形杆菌属
⊕
-
√
-
√
+
注：
+产酸或阳性，⊕产酸产气，-阴性，+/-多数阳性，-/+多数阴性√不确定。
常见肠道感染细菌主要生化反应特征
葡萄糖
乳糖
半固体
大肠埃希菌
⊕
⊕
+
福氏志贺菌
+
—
—
伤寒沙门菌
+
—
+
霍乱弧菌
+
—
+
幽门螺杆菌
不分解糖类
+
变形杆菌
⊕
—
+
对照常见肠道感染细菌主要生化反应特征，血清学分析，说明黄色菌落是金黄色葡萄球菌；白色菌落是白色葡萄球菌；紫黑色菌落是大肠埃希菌；粉红色菌落是福氏志贺菌。
（二）实验综合讨论
1.分析：
（1）、用普通平板，从脓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。
结合菌落色素，这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,附着于菌体表面,形成凝块。
通过血浆凝固酶实验，金黄色葡萄球菌实验结果阳性，为致病菌。
用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落，显微镜下均为G-杆菌，散在排列。
紫黑色金属光泽的产生是因为乳糖被分解产酸，酸使伊红美和蓝紫结合，产生紫黑金属光泽菌落。
紫黑色菌落是能分解乳糖的大肠埃希菌。
致病菌不能分解乳糖，菌落呈现伊红的颜色。
粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。
从形态上不能鉴别是什么细菌。
经糖发酵试验（紫黑色菌落菌种分解葡萄糖和乳糖，产酸产气；粉红色菌落菌种只能分解葡萄糖，产酸不产气）半固体动力试验（紫黑色菌落菌种半固体动力试验结果阳性，有鞭毛；粉红色菌落菌种半固体动力试验结果阴性，无鞭毛）。
对照常见肠道感染细菌主要生化反应特征，判定它们分别是大肠埃希菌和福氏志贺菌。
通过血清学实验，粉红色菌落菌种与福氏志贺菌诊断血清发生凝集反应，进一步确定其为福氏志贺菌。
综上所述，紫黑色的细菌为大肠埃希菌，粉红色的为福氏志贺菌。
2.实验的不足之处：
我们的实验在操作上也产生了许多错误和不足。
（1）在对脓汁标本黄色细菌（金黄色葡萄球菌）进行斜面培养时，在斜面上呈现出柠檬黄色而非金黄色的菌落，经分析认为有一下两种可能：
①选取平板上的菌落时，挑到的菌落并非单一细菌的菌落；②接种到斜面培养基时，接种环挑选菌落后在空气中暴露过久污染导致。
这体现出了微生物实验操作中严格无菌操作的重要性；
（2）平板划线时力道太重且接种环持握过直导致在平板上留下划痕，往后需多次平板划线使动作熟练；
（3）液体培养基实验中，本组粉红菌落的液体培养基较澄清，结果表明粉红细菌可能接种失败；
（4）本次抑菌圈实验中，对抑菌圈的大小造成影响的因素主要是涂布在平板上菌落的密集程度，生长的菌落呈密集或半密集为宜。
由于四个平板分别由不同的人用接种环涂布完成，会产生较大的误差。
如图6.3中，金黄色细菌与白色细菌的菌落密集程度存在明显的差异，因此影响抑菌圈的大小产生误差。
用镊子夹无菌棉花（或用无菌棉签）进行涂布，能够获得较好地涂布效果。
其次，手动测量存在的问题有：
①重现性差，准确性不够：
同一培养皿，不同的人测量结果有差异；②当抑菌圈呈卵原形、边缘模糊或出现双层圈时，边界确定的人为误差大；
3.注意事项：
在培养基配制好后，我们需要检查培养基是否合格。
接种环使用前后必须灼烧灭菌：
接种环使用前，长期暴露于空气中，会带有许多空气中的杂菌，不灼烧灭菌则会导致实验过程中杂菌污染;使用后接种环上带有实验中的相关细菌，若不及时灼烧灭菌会导致前一菌种对后一菌种造成污染,且实验细菌接触外界污染实验室内的相关物品，同学们接触后很可能带来疾病的危险。
平板储存待用或做细菌培养时，需要倒置:
防止平板水分蒸发丢失；防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成；冷凝水中可能含有杂菌，如果滴入平板表面，会影响实验结果。
用革兰氏染色法染色过程中要严格控制四种染料染色的时间（大约一分钟），其中涂片与脱色是关键步骤，如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性，如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性。
流水冲洗时注意水流大小与速度适宜均匀。
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