纯化水需氧菌总数计数方法的验证2015Word文档下载推荐.docx

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1、仪器、设备确认

名     称

型  号

存放地点

厂    家

工作 状态

校验 期至

生化培养箱 （30~35℃） 

HPS-400 

118室

南京实验仪器厂

立式压力蒸汽 灭菌器

LDZX-100KBS 

116室

上海申安医疗 器械厂

生物安全柜

BSC-1100ⅡB2

阳性室

北京东联哈尔仪器 制造有限公司

冰箱

HY-S13-03 

北京低温设备厂

热空气消毒箱

GX625E 

天津市泰斯特仪器 有限公司

检查结果：

检查人：

         复核人：

         日期：

2.1移液器、接种环、酒精灯、记号笔、酒精棉球、试管架、试管、玻璃平皿、止血钳等

2.2需灭菌物品见《微生物限度检查法验证记录》

2.3一次性无菌用具见下表

无菌备品的检查

备品名称

批号

有效期

包装情况

薄膜过滤器

无热原吸头

无菌橡胶医用手套

       复核人：

             日期：

化验员                     经设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培

训，考核合格后上岗。

4、商品培养基及灭菌培养基

4.1 所用培养基均不得有结块、吸潮、异味、颜色发生改变等现象。

培养基检查结果，如下

品名

储藏条件

生产厂家

胰酪大豆胨琼脂培养基

阴凉 干燥处

三年

R2A琼脂培养基

        复核人：

4.2已灭菌培养基的检查结果及结论见《微生物限度检查法验证记录》。

5.1菌种来源：

黑龙江省药检所、公司收集的制药用水系统中的菌落。

菌种确认

  菌种名称

传代日期

代数

管号

传代人

形态确认

铜绿假单胞菌

年  月  日

枯草芽孢杆菌

水系统环境菌（冻干三）

取用一周内该车间水系统环境菌

水系统环境菌（冻干二）

水系统环境菌（固体车间）

5.2菌液的制备

分取铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、水系统环境菌（冻干三）、水系统环境菌（冻干二）、水系统环境菌（固体车间）的新鲜培养物少许接种至胰酪大豆胨琼脂培养基上（环境菌应预先用胰酪大豆胨琼脂培养基平板增菌），30~35℃培养18~24小时；

上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。

 菌悬液制备后在室温下放置，应在2 小时内使用；

若保存在2~8℃可在24h内使用。

 5.2.1阴性对照：

菌液制备时应进行2个平板或试管的阴性对照试验，以确认菌种制备有效。

 5.3菌液菌落数：

详见《微生物限度检查法验证记录》

1稀释液：

氯化钠-蛋白胨缓冲液。

2供试液制备：

薄膜过滤法  

取本品1ml加氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀。

3操作方法：

取上述供试液100ml，按薄膜过滤法过滤，滤完后取出滤膜，菌面朝上贴于已装载冷却凝固的R2A琼脂培养基平板上，平行制备两个平皿。

需氧菌总数计数平板倒置于30~35℃培养箱培养5天。

1.培养基适用性试验及有效期考察

1.1 R2A琼脂培养基制备基础方法：

取18.124g，加水1000ml，微温溶解后，装入4个250ml三角瓶。

使用量较大时，按照验证的装载方式及灭菌程序，在其限定内调整单次灭菌量。

可能的装载方式：

80L灭菌锅 250ml*10瓶*3层或者500ml*7瓶*3层

                  100L灭菌锅 250ml*22瓶*2层或者500ml*15瓶*2层

  灭菌条件为：

121℃、0.1MPa，15min。

含第7日、14日、21日的有效期考察，每次适用性试验需要使用600ml；

共需3次。

1.1.1对照培养基的制备：

取对照培养基一袋，加水300ml，微温溶解，装入相同容积三角瓶中，与被检培养基相同条件同时灭菌。

1.2接种上述5种菌株至待测R2A琼脂培养基平板（每个平板中含培养基15~20ml），每个菌株平行制备2个平板；

同样方法接种上述菌株至对照培养基。

 培养温度30~35℃，时间不超过3天。

被检培养基上每种菌株的平均菌落数与对照培养基上的平均菌落数比值应在0.5~2，且菌落形态大小与对照培养基一致。

1.3在第7日、14日和21日按1.2方法使用1.1配制的R2A琼脂培养基，及新制备的对照培养基进行培养基适用性检查。

稳定性及有效期考察表

次数

比值（0.5~2）及性状一致性

铜绿

枯草

冻干二菌落

冻干三菌落

固体菌落

第一次

第二次

第三次

结论：

评价人：

                                   评价日期：

2需氧菌总数的计数方法验证

2.1设置试验组、菌液对照组、供试品对照组，分别取三个不同日期的供试品（选择储罐取样点）进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

试验菌液为铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌。

（1）试验组  取上述供试液100ml，分别加入含菌数不大于100cfu/ml的试验菌液1ml，按薄膜过滤法过滤。

过滤完毕后取出滤膜，菌面朝上贴于已装载冷却凝固的R2A琼脂培养基平板上，平行制备两个平皿。

（2）菌液对照组  取上述供试液100ml，加入氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，按薄膜过滤法过滤。

过滤完毕后取出滤膜，菌面朝上贴于已装载冷却凝固的R2A琼脂培养基平板上，平行制备两个平皿。

（3）供试品对照组  取氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，分别加入含菌数不大于100cfu/ml的试验菌液1ml，按薄膜过滤法过滤。

过滤完毕后取出滤膜，菌面朝上贴于已装载冷却凝固的R2A琼脂培养基平板上，平行制备两个平皿。

2.2 上述实验三个纯化水车间（冻干粉针二车间、冻干粉针三车间、口服固体制剂车间）同步进行，可使用同一组阴性对照；

培养温度30~35℃，时间不超过3天。

各组实验检查结果及结论见检验记录。

2.2.1需要主要材料：

、已灭菌R2A琼脂培养基720ml、薄膜过滤器36套。

2.3计算菌回收率公式：

试验组菌的回收率=

试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数

菌液对照组的平均菌落数

计数方法适用性表

回收率比值（冻干二）

回收率比值（冻干三）

回收率比值（固体）

3.供试品检查

3.1每个车间三批样品（同一个点、不同日期，减少随机误差，便于统计分析，）按上述验证的方法检验，即取水样1ml，加氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，取该100ml溶液进行薄膜过滤，取滤片，菌面向上，贴于R2A琼脂培养基平板；

平行制备两个平板，同法以氯化钠-蛋白胨缓冲液代替样品进行阴性对照试验；

将上述平板于30~35℃培养不少于5天；

阴性对照不得有菌生长（同时检验的各批产品可使用一个阴性对照平板）且三批检验均应能获得准确结果。

3.2每日主要材料：

已灭菌R2A琼脂培养基200ml，薄膜过滤器10套。

3.3检验结果

日期

车间

冻干二

冻干三

固体

月  日

                                评价日期：

六、验证结果及评价：

方案实施人员是否经过相关技术培训或路演   口；

实施前仪器设备操作及人员能力确认是否有效  口；

 实施前相关校准、检定及标准物质、关键耗材准备是否充分   口；

 实施项目是否完整、正确  口；

实施过程是否未曾发生偏差、变更或其它异常  口；

 需要说明的情况：

                         评价日期：

七、再验证周期：

    需要进行本次再确认的情况主要有：

纯化水生产工艺变更、检验培养基供应商变更、检验用薄膜过滤器的形式变更；

检验人员的不稳定因素；

若有其他可能影响计数准确性的变更应考虑实施本确认。

否则，本确认再验证周期为5年。

八、验证结论批准：

验证小组：

日期：

附件一：

微生物限度检查法验证记录

品名：

纯化水                 取样口：

           来源：

1.实验室环境

操作室名称 环境

微生物限度室

阳性对照室

压差（Pa）

温度（℃）

湿度（%）

沉降菌（cfu）

                  检查人：

                        日期：

2.灭菌物品确认

灭菌物品

灭菌方式

温度

时间

无菌服、口罩

湿热

平皿、量筒

干热

3.灭菌后培养基的确认

3.1灭菌后培养基瓶和塞子不得有破裂，避免形成气泡，培养基应呈均匀溶液状态，不得有析出沉淀，PH值不能超过规定值的±

0.2，不得污染微生物。

促生长能力符合规定。

已配制灭菌培养基在有效期内，如下表所示：

灭菌 方式

灭菌后pH 

贮藏条件

配制 日期

批号

配制人

胰酪大豆胨液体培养基

          日期：

4.菌液悬液计数结果

稀释级菌落计数检查结果

标准菌株

稀释级/代数

计数结果（cfu）

水系统环境菌（冻干三）

水系统环境菌（冻干二）

水系统环境菌（固体）

制备人：

5.需氧菌总数的计数方法验证

菌落计数结果

组别

铜绿假单胞菌（cfu）

枯草芽孢杆菌（cfu）

菌落数

平均数

试验组

菌液对照组

供试品对照组

试验组菌回收率% 

检验结果：

检验人:

复核人：

附件二：

纯化水微生物限度检验记录

品   名

样品来源

湿   度

温   度

   ℃

检验依据

验证方案

报告日期

  年    月    日

方法：

取本品

（1）     ml，加氯化钠-蛋白胨缓冲液至（100）     ml，制备两份，分别混匀以薄膜滤器过滤，分别取下滤膜，菌面向上贴在R2A琼脂平板上（避免产生气泡），同法制备阴性对照平板2个；

传出上述平板，置30~35℃培养箱培养；

每日观察，观察5天，计数、计算结果。

主要仪器、设备、耗材：

热空气消毒箱           型号：

GX625E         编号：

HY-104

立式压力蒸气灭菌器     型号：

LDZH-100KBS    编号：

HY-001

集菌仪                 型号：

HTY-2000B      编号：

HY-089

R2A培养基             批号：

生化培养箱             型号：

HPS-400       仪器编号：

HY-

培养观察

培养温度：

        ℃（30~35℃），培养时间：

           天（5天）

阴性对照：

        （末次观察时不得染菌，观察日期：

    月   日~    月   日）     样品：

取样点：

观察日期

需氧菌总数 单位cfu/ml 平板1/平板2

    /     

    /    

均值：

          cfu/ml

结论

本品按验证方案检验，结果：