注射用头孢曲松钠中抗氧剂测定方法的建立.docx

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注射用头孢曲松钠中抗氧剂测定方法的建立

注射用头孢曲松钠中抗氧剂测定方法的建立

【摘要】目的建立测定注射用头孢曲松钠中抗氧剂2，6-叔丁基-4-甲基-苯酚（BHT）的HPLC方法。

方法AlltimaC18色谱柱（×250mm，5μm），以乙腈∶水（77∶23）为流动相，检测波长208nm，流速/min，柱温为室温。

结果色谱图中抗氧剂BHT与其他成分的分离度及其检出灵敏度完全满足检测要求，最小检出量为。

结论本法简便、专属、能有效控制产品的质量。

【关键词】抗氧剂；头孢曲松钠；高效液相色谱法

ABSTRACTObjectiveTodevelopanHPLCmethodfordeterminationofbutylatedhydroxytoluene（BHT）inceftriaxonesodiumforinjection.MethodsBHTandotherrelatedsubstancesinceftriaxonesodiumwereseparatedbyamobilephaseconsistedofacetonitrile∶water（77∶23,V/V）ataflowrateof/minonanAlltimaC18columnanddetectedat208nm.ResultsTheresolutionandsensitivityofBHTwereacceptable.Thedetectionlimitwas　ng.ConclusionsThismethodsimpleandspecifictobeusedforthequalitycontrolofceftriaxonesoeiumforinjection.

KEYWORDSAntioxidant;Ceftriaxonesodium;HPLC

头孢曲松钠（ceftriaxonesodium）是由瑞士Roche公司在20世纪80年代推出的第三代头孢菌素。

贮存过程中，注射用头孢曲松钠溶液易变混浊以至澄清度不符合中国药典的规定。

在2000年全国注射用头孢曲松钠监督抽验中共抽查126个批次，22批不合格，其中溶液澄清度不合格的有16批，占不合格样品总数的73%。

BHT本身是一种酚类抗氧剂，能抑制或减缓高分子材料自动氧化反应速度的物质，主要用于橡胶、塑料等加工工业，也作为油脂抗氧剂使用。

近年来，国外不少学者研究发现，BHT对肺、肝等组织有直接损害作用，并有促进肿瘤发生的可能［4，5］，故建立注射用头孢曲松钠中抗氧剂BHT含量的测定方法，对控制产品的质量非常必要。

本文旨在建立一种测定注射用头孢曲松钠样品中抗氧剂BHT含量的HPLC方法，为进一步研究丁基胶塞与药物的相容性奠定了基础，国内外未见报道。

1仪器与试药

Waters2690HPLC系统（Waters996PhotodiodeArrayDetector）；BHT从Sigma公司购买。

注射用头孢曲松钠的样品来源：

样品1：

注射用头孢曲松钠（批号04072614）由山东瑞阳制药有限公司提供；样品2：

注射用头孢曲松钠（批号020228）由珠海联邦制药厂有限公司提供；样品3：

注射用头孢曲松钠（批号000124）由中外合资通化茂祥制药有限公司提供；样品4：

注射用头孢曲松钠（批号000301）由重庆药友制药有限公司提供；样品5：

注射用头孢曲松钠（批号000303）由昆明积大制药有限公司提供；样品6：

注射用头孢曲松钠（批号20000402）由中日合资哈尔滨博利尔药业有限公司提供。

乙腈为色谱纯试剂，丙酮为国产分析纯，水为高纯水。

2方法

　样品溶液的配制

取整瓶样品（标示量/瓶）置20ml顶空瓶中，加入10ml丙酮，用超声波超声5min，配制成100mg/ml的头孢曲松钠混悬液，静置后，取上清液用有机滤膜过滤后，取20μl滤液注入液相色谱仪，记录色谱图。

　色谱条件

色谱柱：

AlltimaC18（×250mm，5μm）；流动相：

乙腈∶水（77∶23）；流速/min；柱温为室温，检测波长208nm；样品浓度100mg/ml；进样体积20μl。

3结果与讨论

　方法学考察

（1）线性考察精密称取BHT，置于50ml容量瓶中，用丙酮溶解并稀释至刻度，摇匀。

精密量取1ml置50ml容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为μg/ml的溶液。

依次吸取、、和至10ml的容量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，分别配制成浓度为、、和μg/ml的溶液，分别取各溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

　　以进样浓度对峰面积回归，得回归方程

A=+r2=

说明BHT在～μg/ml的浓度范围内，峰面积与进样浓度呈良好的线性。

（2）精密度考察取浓度为μg/ml的BHT的对照品溶液重复进样5针，主峰峰面积的RSD为%，可见方法的精密度良好。

（3）最低检出限和最低定量限考察以信噪比为3∶1计算最低检出限为；以信噪比10∶1计算最低定量限为。

（4）溶液的稳定性考察取含量测定项下的样品溶液，将溶液在室温条件下放置0、4、8和24h后，分别进样20μl，记录色谱图，计算主峰峰面积的相对标准偏差（RSD%）为%，说明溶液在24h内保持稳定，可保证检测结果的准确性。

（5）回收率考察注射用头孢曲松钠样品（批号020228，由珠海联邦制药厂有限公司提供）中没有能够检出抗氧剂BHT，所以将此批样品作为空白样品，进行加样回收率考察。

取整瓶注射用头孢曲松钠样品，分别加入浓度为μg/ml的BHT对照溶液、和，每个体积各两份，然后分别加、和丙酮，用超声波超声5min，充分摇匀，使成混悬液。

静置后取上清液，用有机滤膜过滤，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，并计算回收率（图1和表1）。

　样品测定结果

样品溶液的配制方法同，每批样品取5瓶同时测定。

从测定的结果可以看出，所测定的6批样品中有两批样品没有检测到抗氧剂BHT，其它4批样品均检出了一定量的抗氧剂BHT，但是不同批次的样品之间所含抗氧剂BHT的差别比较明显（表2）。

表2不同批次样品中所含抗氧剂BHT的含量测定结果

　讨论

（1）溶解样品的溶剂选择头孢曲松钠本身能溶于水，抗氧剂BHT则不溶于水。

所以测定样品中的抗氧剂BHT应选择有机溶剂溶解样品，使样品中的抗氧剂BHT充分溶解；而头孢曲松钠不溶解，减少了头孢曲松钠对样品中抗氧剂BHT测定的干扰。

选择乙醇和丙酮两种有机溶剂进行考察。

取整瓶样品（每瓶）置20ml顶空瓶中，分别加入10ml无水乙醇和丙酮，用超声波超声5min，配制成100mg/ml的头孢曲松钠混悬液，静置后取上清液用有机滤膜过滤后，取20μl续滤液注入液相色谱仪，记录色谱图。

发现用两种有机溶剂溶解样品，所得到的抗氧剂的峰面积没有明显差异，但用无水乙醇溶解样品的色谱图中，头孢曲松钠的色谱峰比较明显，而且由于配制的浓度比较大，造成色谱柱超载，对色谱柱有一定的损害；在采用丙酮溶解样品的色谱图中，基本没有出现头孢曲松钠的色谱峰，最终选择丙酮作为溶解样品的有机溶剂。

（2）检测波长的选择从抗氧剂BHT的紫外吸收光谱图中可以看出（图略），抗氧剂BHT在200～400nm的波长范围内存在两个吸收峰，分别在208和276nm处。

由于注射用头孢曲松钠样品中所含有的抗氧剂BHT的量均比较少，为达到较高的检测灵敏度，我们选择208nm作为抗氧剂BHT的检测波长。

（3）色谱条件的选择有些样品溶液的色谱图中（图略）抗氧剂BHT前有一相邻杂质峰，与抗氧剂BHT较难分离。

在用乙腈∶水（79∶21）作为流动相时，抗氧剂BHT与相邻杂质则不能很好分离；改用乙腈∶水（77∶23）作为流动相时，两者可以很好分离。

（4）样品测定的均匀度在测定样品的过程中，每批样品均取5瓶样品进行测定，结果显示，除了一批样品所含的抗氧剂BHT的量较高，5份样品测定结果的RSD小于%外，其它三批样品的RSD均较大，在%左右。

除了样品中所含有的抗氧剂BHT比较微量的原因外，主要是因为样品中的抗氧剂BHT均来自药品包装所用的药用丁基胶塞，不同的样品与胶塞的接触时间、面积都在贮存过程中存在一定的不同，同时每瓶样品所用的丁基胶塞也存在一定的差异，对样品的测定结果也会带来一定的影响。

（5）GC-FID法测定的问题曾利用GC-FID的色谱条件测定注射用头孢曲松钠中含有的抗氧剂BHT，方法是将注射用头孢曲松钠样品配制成100mg/ml的水溶液，顶空条件为80℃顶空30min。

但实验过程中发现存在如下主要问题：

①对照溶液的配制。

由于抗氧剂BHT对照试剂本身不溶于水，所以无法用水配制对照溶液。

实验中，曾尝试先用丙酮配制一定浓度的对照溶液，然后取少量对照溶液置20ml顶空瓶中，将丙酮在室温条件下挥发，然后加2ml水，将顶空瓶密封后顶空加热进样，但重现性不好；②灵敏度较差。

测定的最低检出限在微克水平，由于样品中含有的抗氧剂BHT相对比较少，所以方法的灵敏度不好，直接影响样品中抗氧剂BHT的检出。

【参考文献】

［1］涂林，余方键，胡昌勤.国产注射用头孢曲松钠的质量现状［J］.中国药事，2002，16

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［2］肖全英，雪芳，曾环想，等.注射用头孢曲松钠的胶塞相容性研究［J］.广东药学院学报，2004，20（6）：

610～611.

［3］ZhaoX,JinSH,HuCQ.Theeffectofrubberclosuresonthehazestateofceftriaxonesodiumforinjection［J］.DrugDevIndPharm,2007,33

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35～44.

［4］KehrerJP.Bleomycinandcyclophosphamidetoxicityinmicewithlungtissue［J］.Toxicology,1989,57

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69～82.

［5］PowellCJ,ConnellyJC,JonesSM,etal.HepaticresponsestotheadministrationofhighdosesofBHTtotherat:

theirrelevancetohepatocarcinogenicity［J］.FoodChemToxicol,1986,24（10～11）:

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