食品微生物的检测分离纯化和初步.docx

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食品微生物的检测分离纯化和初步

广州大学

综合设计性实验报告

学院生命科学学院

課程微生物学实验

实验项目实验八食品微生物的检测、分离纯化和初步

鉴定

实验题目北亭村饭店饮用水微生物的检测、分离纯化和初步鉴定

专业生物科学

年级、班别10级生科2班

姓名费欢

学号1014100060

任课教师钱黎明

完成日期2012年12月2日

实验八食品微生物的检测、分离纯化和初步鉴定

—北亭村饭店饮用水微生物的检测、分离纯化和初步鉴定

摘要：

了解北亭村饭店饮用水卫生状况，为北亭村饭店饮用水的安全提供参考。

饮用水中细菌总数可说明被污染的程度，细菌数越多，污染越严重。

本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌菌落总数、稀释平板法和平板划线法分离纯化菌落、进行生理生化鉴定。

由于饮用水中细菌种类多，他们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，是饮料中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以某种培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的细菌总数仅是近似值。

本实验采用普通营养琼脂培养基，该培养基营养丰富，能使大多数细菌生长。

所谓细菌总数，指1毫升检样中所含的细菌菌落的总数。

还有就是通过VP反应和MR反应、糖发酵试验、淀粉水解实验、革兰氏染色以及芽孢染色等初步的鉴定试验来进行检测。

通过观测得到如下结果：

观察到众多的菌落且种类繁多，取其平均值得到，总菌落数为每毫升饮用水中4600个细菌菌落，不符合国家饮用水卫生标准。

关键词：

饮用水微生物检测分离纯化鉴定

目录

1前言

2实验原理

3实验用品

3.1器材

3.2试剂

3.2.1培养基

3.2.2试液

3.3材料

4实验方法

4.1技术路线

4.2实验步骤

5实验原始记录

6结果分析与讨论

6.1实验结果

6.2讨论

7参考文献

1.前言

1.1目的：

［1］检索并了解国家相关的食品卫生标准，了解细菌总数，霉菌总数、酵母菌总数，大肠菌群数在食品卫生学评价中的意义；

［2］学习并完成实验设计；

［3］应用细菌的分离和活菌计数的基本方法、掌握相关原理；

［4］对分离到的微生物（细菌，霉菌）进行初步的形态学观察，对分离的细菌进行鉴别染色以及生化鉴定；

［5］学习和掌握快速大肠菌群检测纸片的检测方法；

1.2意义：

微生物学指标是评价食品污染的重要指标，是食品上安全的保证。

水是生命之源,人的生存离不开水环境，水质的好坏对人们生活起着至关重要的作用。

随着环境污染的不断增加及人民生活水平的不断提高,人们越来越重视日常饮用水的水质卫生。

饮用水的卫生安全对于提高人们的卫生水平、增进健康、防止疾病都有重要的意义。

因此生活饮用水的卫生质量的优劣也愈来愈受到社会和公众的关注。

各种天然水中常含一定数量的微生物。

水中微生物的主要来源是：

水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。

为了解北亭村饭店饮用水的卫生状况,我们对北亭村饭店饮用水进行了微生物检测。

我们想通过测定北亭村饭店饮用水的细菌菌落总数，了解其质量情况，呼吁人们应尽量少去北亭村饭店消费，北亭村饭店也应该改善其饮用水水质。

1.3方法：

本实验只包括一群能在普通营养琼脂培养基上生长的嗜中温的需氧的细菌菌落总数。

通过此实验我们能够计算出北亭村饭店饮用水中的细菌菌落总数，从而判断北亭村饭店饮用水是否符合国家标准，是否受到污染。

并通过稀释平板法和平板划线法，分离纯化细菌。

同时也对其进行淀粉水解实验、MR反应和VP反应、糖发酵试验、革兰氏染色以及芽孢染色等初步的鉴定试验来进行检测。

2.实验原理

2.1培养基的配制与灭菌

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。

但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。

配制培养基是不仅需要考虑满足这些营养成分的需求，而且应该注意各营养成分之间的协调。

此外不同微生物对pH要求不一样，酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性（嗜碱细菌和嗜酸细菌例外）。

所以配制培养基时都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。

配制培养基的流程如下：

原料称量、溶解、加琼脂熔化、调节pH值、分装、塞棉塞和包装、灭菌

由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。

实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。

高温的致死作用，主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要大分子发生变性。

高压蒸汽灭菌是微生物研究和教学中应用最广、效果最好的灭菌方法，本实验同样采用高压蒸汽灭菌。

2.2微生物的分离与纯化

自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

一般是根据微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某些抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其他菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。

分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法。

本次是从中菌悬液中分离多种菌株，实验将采用稀释平板法分离纯化菌种。

2.3分离菌株的鉴定

微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、形态、细菌特点及生理生化等方面进行鉴定。

各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。

不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和过氧化氢的能力不同。

这些都反映了它们是有不同的酶系统。

细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：

第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础。

另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物[1]。

*细菌总数，霉菌和酵母菌总数是反映样品的卫生质量的微生物学指标，是指食品经过处理，在一定条件下培养后（37℃培养24h），所得1g或1ml检样中所含的菌落总数。

菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

实际上，菌落总数并不完全反映样品中实际存在的所有细菌的数量，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

3.实验用品

3.1器材普通光学显微镜，电子秤，高压灭菌锅,超净工作台，恒温箱，250mL锥形瓶，无菌培养皿，无菌试管，移液枪，载玻片，胶头滴管，普通漏斗，铁架台，杜氏小管，烧杯，擦镜纸，酒精灯,接种环，试管架，酒精棉球，吸水纸，无菌平板，三角玻棒，标签纸，pH试纸，比色卡，玻璃棒,无菌棉塞，药匙等。

3.2试剂

3.2.1培养基牛肉膏蛋白胨培养基，乳糖发酵培养基，葡萄糖发酵培养基，固体淀粉培养基，葡萄蛋白胨水培养基。

3.2.2试液无菌（生理盐）水，95%乙醇，香柏油，甲基红，40%KOH,5%α-萘酚溶液,石炭酸复红，卢戈氏碘液，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红精水溶液，草酸铵结晶紫染液。

3.3材料食品检样——北亭村饭店饮用水。

4.实验方法

4.1技术路线培养基的配制→倒斜面→无菌水的制备→清洗玻璃仪器→玻璃仪器、培养基灭菌→微生物的分离与纯化→接种→倒平板→菌落计数→接种菌株到斜面→分离菌株的鉴定→观察和记录

4.2实验步骤

4.2.1培养基的制备与分装。

［1］称量：

按培养基配方比例依次准确地称取药品。

见附表1.

［2］溶化：

在沸水浴锅中加热熔化。

［3］调pH：

用1mol/LNaOH调pH至培养基所需pH。

［4］分装：

将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装大试管时，注意管口不要沾上培养基。

大试管固体分装装量不超过试管的1/5，灭菌后倾斜放置。

［5］加棉塞：

培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层报纸。

试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎报纸，贴上标签，注明培养基名称、组别。

4.2.2倒斜面。

将制备好的牛肉膏蛋白胨培养基分别倒入5支试管中，灭菌后，趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。

4.2.3无菌水的制备。

用移液管取9mL蒸馏水于6支小试管中，塞上棉塞，包扎报纸。

4.2.4器皿的准备。

［1］玻璃仪器初步清洗

［2］培养皿的包装：

每5套一包，用旧报纸包扎。

［3］移液管的包装：

首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。

［4］玻璃涂布棒的包装：

方法同移液管的包装。

4.2.5高压灭菌。

将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间121℃，20min灭菌。

4.2.6微生物的分离与纯化。

［1］稀释平板分离法：

将5支9ml的无菌水试管排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5依次编号。

在无菌操作条件下，用移液枪吸取1ml菌悬液置于第一支试管中，震荡市管混合均匀即为1/10浓度的菌液。

用l毫升无菌移液枪吸取lml1/10浓度的菌液于第二支试管，摇匀即为10-2浓度菌液。

同样方法，依次稀释到10-3。

稀释过程如图

稀释液和原液移入平皿后，将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。

同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。

冷凝后将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24-48h。

[2]平板划线分离法：

平板的制作：

取6套无菌培养皿编号1、2、3、4、5，于相应编号的培养皿内加热融化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖．靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，冷凝后即成平板。

划线：

用接种环蘸取原液平板划线分离，置于37℃恒温箱中培养48h，然后观察结果。

4.2.7菌落计数

采用平皿菌落技术法，肉眼数出平板上菌落数目。

4.2.8接种菌株到斜面

将分离到的不同菌株分别无菌操作接种到斜面。

4.2.9分离菌株的鉴定。

［1］观察菌种的培养特征。

［2］细菌的革兰氏染色，记录菌体特征与染色特性。

I制片：

制片方法与简单染色相同。

II初染：

加适量（以刚好覆盖菌为宜）的结晶紫染色液染色1.5min，水洗。

III媒染：

碘液媒染1min，水洗。

IV脱色：

连续滴加95%乙醇脱色20—30s至流出液无色，立即水洗。

V复染：

滴加番红复染1.5min，水洗。

VI晾干：

将染色好的涂片放空气中晾干，用吸水纸吸干载玻片上的水。

VII镜检：

镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

［3］细菌的芽孢染色。

I制片：

按常规方法涂片、干燥及固定。

II加热染色：

向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。

III脱色：

待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。

IV复染：

用石炭酸复红复染2min。

V水洗：

用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。

VI镜检：

镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察芽孢和菌体的形态。

结果：

芽孢呈绿色，菌体呈红色。

［4］进行以下细菌的生理生化试验：

I淀粉水解试验

1将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌操作制成5个平板。

2将选取的菌株分别在平板上点一下。

3将平板倒置在37℃温箱中培养24h。

4观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。

II糖发酵试验

1葡萄糖发酵；②乳糖发酵。

取葡萄糖发酵管与乳糖发酵管各5支，标记，接种，37℃培养24-48h。

IIIIMVIC试验

将分离到5种菌株分别接种于10支葡萄糖蛋白胨水培养基，37℃培养48h；

2MR试验：

37℃培养48h后，取出加甲基红试剂3～5滴，观察结果。

3VP试验：

37℃培养48h取出后在培养液中先加40%KOH溶液5-10滴，再加等量5%α-萘酚溶液，充分混匀。

再放入37℃中保温15-30min后观察结果。

5实验原始记录

实验原始数据

表一：

北亭村饭店饮用水被稀释的细菌菌落数

稀释倍数

10-1

10-2

10-3

10-4

细菌数

>300

46

17

11

表二：

分离菌株形态特征

菌株

形态特征

A

乳白色，干燥，小

B

白色，湿，小

C

浅黄，湿，中

D

乳白色，湿，大

E

黄色，干燥，小

表三：

淀粉水解试验结果

菌种

实验现象

A

-

-

-

+

-

B

C

D

E

符号说明：

在平板上滴加路哥氏碘液呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，记为“+”，称为试验阳性；否则，记为“-”，称为试验阴性。

表四：

糖发酵试验结果

菌株

实验现象

葡萄糖

乳糖

A

+

-

B

+

-

C

+

-

D

+

-

E

⊕

⊕

符号说明：

试验菌产气泡且产酸记为“⊕”，只产酸记为“+”不产气也不产酸记为“-”。

表五：

MR试验和VP试验结果

菌株

实验现象

MR实验

VP实验

A

-

+

B

-

+

C

-

+

D

-

+

E

+

-

符号说明：

记为“+”，称为试验阳性；记为“-”，称为试验阴性。

表六：

芽孢试验结果

菌株

实验现象

A

-

B

-

C

-

D

-

E

-

符号说明：

试验菌有芽孢记为“+”；否则记为“-”。

表七：

显微镜观察和革兰氏染色试验结果

菌株

实验现象

A

中，杆状，G+

B

极小，杆状，G+

C

小，圆形，G+

D

大，杆状，G+

E

小，杆状，G-

6结果分析与讨论

6.1实验结果：

表八：

1ml样品含菌落总数

样品

饮用水

1ml含菌落数（个）

4600

由表一的数据可得表八，在10-2浓度下，北亭村饭店饮用水中含有的菌落数为46个，即1ml饮用水中含有的菌落数为4600个。

根据参考文献中附表

（一）中华人民共和国相关食品安全卫生标准所示，被测北亭村饭店饮用水1ml含菌落总数为4600>100cfu/ml，不符合国家卫生标准。

6.2讨论：

生活饮用水的卫生状况直接影响人类健康。

据世界卫生组织报告，全世界每年因水污染导致12亿人患肠道传染病，每年约400万儿童死于水致传染病〔2〕。

可见，微生物污染已成为饮用水最常见、最普通的健康危险因素，其造成的严重后果提示应严格控制微生物污染。

目前，我国饮用水的微生物安全性问题尚未得到有效保障，微生物超标现象普遍存在〔3〕。

生活中微生物可谓无处不在，细菌是微生物界的一个大类群，它与人类的生活密切相关，其中有的有益，有的有害。

为了我们更好的生活，我们必须研究细菌，并掌握一些方法，来使细菌向人类有用的方面发展。

实验用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取北亭村饭店饮用水样品，利用培养基制作平板，在37℃温箱中，培养48h，进行菌落记数。

通过与国家标准进行对比可知远远超过在国家标准范围，属于不合格的饮用水。

以及通过细菌生理生化反应，发现饮用水中都存在着多种不同的菌落，而且我们挑取了比较多的而且明显的菌落进行的鉴定，发现5个菌落中有4个是革兰氏阳性菌，杆状菌较多。

而其中E样品，为黄色的菌种，在糖发酵中，产酸产气，而且经多个实验观察与显微镜观察与比较，判断出其为大肠杆菌。

通过此实验，我们可知平板菌落技术法是测定水样中细菌个数比较方便的方法，但它也存在不准却的因素比如在数菌落时，菌落太小且又处于培养基内部这样就不能观察到菌落从而影响结果，又如在培养过程中由于细菌之间的相互抑制也会使计数菌落减少。

因此，在制作培养基及培养的过程中要严格杀菌，并严格按照实验步骤认真操作，从而使得结果更加精确。

由实验结果可知，北亭村饭店饮用水极不卫生，因此，卫生部门应加强对北亭村饭店卫生监督和管理，改善其饮用水卫生状况，确保饮用水的安全卫生。

对于消费大众来说，我们应该尽量避免到北亭村饭店用餐。

7参考文献

[1]黄秀梨、辛明秀.微生物学实验指导.（第二版）.北京：

高等教育出版社.2008：

1-27、48

[2]郑炳辉，付青，刘琰.中国城市饮用水源地环境问题与对策〔J〕.环境保护，2007，22（19）:

59－61.

[3]张岚.2006年全国生活饮用水卫生安全情况调查和分析〔J〕.环境与健康杂志，3007，24（8）:

595－597.

附表：

表一：

1.纯净水依据中华人民共和国GB17324-1998规定:

菌落总数≤20cfu/mL,大肠菌群≤3MPN/100mL,酵母、霉菌不得检出；

2.矿泉水依据依据中华人民共和国GB8357-1995规定:

菌落总数≤50cfu/mL,大肠菌群≤0MPN100mL，酵母、霉菌不得检出。

3.生活饮用水（自来水）：

细菌总数≤100CFU/mL；总大肠菌群每100mL水样不得检出；粪大肠菌群每100mL水样不得检出。

生活饮用水水源水质标准GB8161：

生活饮用水水源水质分为二级，其两极标准的限值见下表。

表1.生活饮用水水源水质标准GB8161（大肠菌群指标）

大肠菌群（个/L）

一级水源

≤1000

二级水源

≤10000