仁康医院检验科微生物操作解读.docx

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仁康医院检验科微生物操作解读

展辉医院检验科

微生物检验操作程序（SOP）

（第一版）

制作人：

刘新平

启用日期：

2011年5月28日

目录

微生物室工作岗位职责……………………………………………………………4

微生物检验室内质控操作程序（SOP）…………………………………………4

微生物室标本接收程序（SOP）…………………………………………………8

微生物室标本接种程序（SOP）…………………………………………………9

病原微生物污染处理程序（SOP）………………………………………………10

血液及骨髓培养标准操作程序（SOP）…………………………………………11

痰（咽拭）培养标准操作程序（SOP）…………………………………………12

尿液培养标准操作程序（SOP）…………………………………………………13

胆汁培养标准操作程序（SOP）…………………………………………………14

脑脊液培养标准操作程序（SOP）………………………………………………15

脓液及伤口分泌物培养标准操作程序（SOP）…………………………………16

粪便培养标准操作程序（SOP）…………………………………………………17

穿剌液培养标准操作程序（SOP）………………………………………………19

生殖系统细菌培养程序（SOP）…………………………………………………20

细菌常规鉴定程序（SOP）………………………………………………………21

细菌涂片染色程序（SOP）………………………………………………………28

革兰阳性球菌的鉴定………………………………………………………………30

葡萄球菌属的鉴定………………………………………………………………30

微球菌属的鉴定…………………………………………………………………32

链球菌属的鉴定…………………………………………………………………32

肠球菌属的鉴定…………………………………………………………………33

气球菌属的鉴定…………………………………………………………………34

革兰阴性球菌的鉴定………………………………………………………………35

奈瑟菌属细菌的鉴定……………………………………………………………35

韦荣球菌属细菌鉴定……………………………………………………………35

革兰阳性杆菌的鉴定………………………………………………………………36

李斯特菌属与丹毒丝菌属的鉴定………………………………………………36

棒状杆菌属的鉴定………………………………………………………………36

诺卡菌属的鉴定…………………………………………………………………37

红球菌属的鉴定…………………………………………………………………38

芽胞杆菌属的鉴定…………………………………………………………………38

肠杆菌科的细菌鉴定………………………………………………………………38

弧菌属的鉴定………………………………………………………………………39

气单胞菌属的鉴定…………………………………………………………………40

不动杆菌属的鉴定…………………………………………………………………40

莫拉菌属的鉴定……………………………………………………………………41

金黄杆菌属的鉴定…………………………………………………………………41

假单胞菌属的鉴定…………………………………………………………………41

嗜血杆菌属的鉴定…………………………………………………………………42

放线杆菌属的鉴定…………………………………………………………………42

产碱杆菌属的鉴定…………………………………………………………………43

布鲁菌属的鉴定……………………………………………………………………43

军团菌属的鉴定……………………………………………………………………43

弯曲杆菌科细菌的鉴定……………………………………………………………43

消化球菌属和消化链球菌属的鉴定………………………………………………44

拟杆菌属及梭杆菌属的鉴定………………………………………………………44

厌氧无芽胞革兰阳性杆菌的鉴定…………………………………………………44

梭状芽胞杆菌属的鉴定……………………………………………………………45

临床真菌的检验及鉴定……………………………………………………………46

毛癣菌属的鉴定…………………………………………………………………46

小孢子菌属的鉴定………………………………………………………………46

念珠菌属的鉴定…………………………………………………………………47

隐球菌属的鉴定…………………………………………………………………47

曲霉菌属的鉴定…………………………………………………………………48

毛霉属和根霉菌属的鉴定………………………………………………………48

镰孢霉属的鉴定…………………………………………………………………48

马尔尼菲青霉菌的鉴定…………………………………………………………48

荚膜组织胞浆菌的鉴定…………………………………………………………49

申克孢子丝菌的鉴定……………………………………………………………49

微生物药敏试验程序………………………………………………………………49

药敏质控程序………………………………………………………………………51

医院环境卫生学监测………………………………………………………………53

空气含菌量的监测………………………………………………………………53

工作人员手细菌监测……………………………………………………………54

物体表面细菌的监测……………………………………………………………54

消毒剂的监测……………………………………………………………………55

无菌物品的监测…………………………………………………………………55

血液培养仪BacT/ALERT3DSelect操作程序…………………………………56

ATBTM接种操作程序………………………………………………………………56

微生物鉴定/药敏鉴定ATBTM操作…………………………………………………57

微生物室工作岗位职责

1、负责全院临床各科细菌检验标本的验收，各种微生物检测；细菌培养手工和上机分析鉴定及药敏试验；支原体和衣原体检测；院感监测及其室内室间质控工作等。

各项操作严格按照标准化操作程序（SOP）进行。

2、每天检查细菌自动分析仪工作是否正常；观察培养箱温度、室内湿度、冰箱温度是否符合要求，并做好记录。

查看培养基、各种生化管、试剂、药敏纸片、染色液等是否满足检测要求，并及时更新或配制。

3、检查细菌培养申请单及原始登记本，确定标本接种是否正确。

观察培养基、血液增菌培养瓶生长状况，如发现有细菌生长立即进行移种，并涂片革兰染色，将细菌的染色特性及形态做好记录，及时通知临床医生。

4、检测分析细菌，挑取可疑菌落涂片革兰染色镜检，将菌落纯分于血平板，做生化鉴定和药敏试验或上机分析鉴定，并及时发放检验结果报告。

5、做好菌种的保存，对一些难得的菌株、标准菌株等要定期移种，一般一月一次，低温保存；做好移种记录，并做好生物安全防护。

6、定期做好所用药敏纸片的质控，每周一次并有记录；3-6个月画一次质控图并有分析；对检验样本的数量、样本的阳性率、各种细菌的耐药性、各类细菌检出构成的百分比进行统计，并打印成文统一保存。

7、经常保持室内的清洁卫生，生活垃圾与医疗垃圾要分装处理；每天下班对室内空气进行消毒处理；生物安全防护严格执行医院《医务人员职业暴露防护制度》。

微生物检验室内质控操作程序（sop）

一、目的：

规范微生物检验及室内质量控制，保证细菌检测及药敏结果的可靠性。

二、程序的更改：

该标准操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人员提出，并报请专业组长及科主任批准签字后生效。

三、控制方法

（一）对实验室人员的要求

每个实验室的技术人员数要充足，且要具备良好的职业道德。

凡参加细菌检验的技术人员，要有一定的理论知识和实践能力水平。

要有广泛的基础训练教育，而且要在一位有经验的微生物学家的监督下，进行实际工作的严格训练，对新工作人员，除教会基本原理和操作外，还应对其进行职业道德教育。

（二）实验室操作手册

制定微生物检验室标准化操作程序的手册，内容要全面，文字应简练，间隔一定时间要进行修改、删旧补新。

操作手册一般包括以下内容：

①实验室的规章制度：

包括各级人员职责、权限及各项有效的制度，如标本的接收、报告的发送、交接班、轮换、消毒隔离及安全制度等。

②样品采集、运送与处理；③细菌检验流程及检测工具；④检验方法与质控方法（细菌分离、培养、鉴定与药物敏感试验）；⑤试剂和培养基质量控制；⑥仪器操作手册；⑦报告方式；⑧临床意义及参考数据；⑨实验室安全。

（三）仪器设备的质控

1、高压灭菌器及干热灭菌器：

使用灭菌器应遵守仪器操作规程。

物品灭菌时，应同时放入监控指标。

生物指标应用嗜热脂肪芽胞杆菌悬液，装入试管或安培瓶，也可用纸带。

化学指标用对热敏感的染料标记的变色带子。

灭菌时，将试管或安培瓶、纸条或变色带等夹放在试验包裹中，以监视灭菌效果。

对大型灭菌器，监视指标应放在不同位置。

2、培养箱、水浴箱及冰箱：

①温度要求：

培养箱35℃±1℃；水浴箱37℃±0.5℃；冰箱4℃±2℃，冰格－5℃±1℃；低温冰箱－20℃±2℃；超低温冰箱－80℃±10℃。

②温度记录：

每天在工作开始和结束时记录温度，这类仪器要放入最高、最低温度计监视。

3、二氧化碳培养箱：

二氧化碳培养箱内的CO2含量控制在5％－10％之间。

4、厌氧缸及厌氧培养箱：

工作时应保证绝对无氧，在使用时应用化学和生物学两种指标进行监视。

化学指标用美蓝或刃天青，无氧时均为无色；生物学指标用诺维氏芽胞梭菌，如厌氧装置有隙缝时，该细菌即不生长。

钯粒应新鲜并具有活性，用过钯粒通过加热160℃1.5－2小时，重新活化后使用。

5、生物安全箱处理：

对含有分枝杆菌和致病性真菌的标本，或培养物是需要的。

穿过通风橱表面的气流，不应小于30.38M/分，用于消除橱内污染的紫外线灯及滤过装置，必须每隔3个月校正其性能一次，不合格者应调换。

6、接种环要求长5－8cm，环直径约3mm；尿定量接种环，应定期检验其容量是否准确，否则应予校准；接种针长5－8cm。

临床微生物实验室常用仪器设备的质量控制标准见下表。

表1常用仪器设备的质量控制

仪器设备名称

控制标准

允许范围

监控方法和频率

光学显微镜

每年4次或需要时，作清洁与调试

培养箱

35℃

±1℃

每天观察记录温度

二氧化碳培养菌

每天观察记录温度和

温度

35℃

±1℃

二氧化碳浓度

气体

5%-10%

<10%

冰箱

每天观察记录温度

冷藏室

4℃

±2℃

冷冻室

-5℃

±1℃

低温冰箱

-20℃

±2℃

每天观察记录温度

压力蒸汽灭菌器

121℃

≥121℃

使用时观察并记录温度、压力，每周用嗜热芽孢菌或每次用化学方法测试灭菌效果

随着医学检验学科的不断发展，许多自动化仪器和微量生化反应系统相继进入微生物实验室。

给细菌和真菌的培养、鉴定与药敏试验，带来快速准确的结果。

对于这些仪器设备的质量控制，可根据厂商说明书推荐的方法去做，确保测试系统的灵敏度和精密度。

（四）培养基的质控

　　实验室每一次制备的培养基作为一批，标明批号；商品培养基则以同一时间内生产的，相同批号作为一批。

如果同一批号不在同一个月内使用，则培养基应重新用标准菌株进行考核。

因此，必须对培养基作以下三方面质控。

1、一般性状

培养基一般性状包括外观、厚度、pH值等。

刚配制的液体培养基，其外观应透明、清亮、无混浊、无沉淀，颜色符合要求。

新鲜的固体培养基应具有特定的颜色，表面湿润但无水汽、平整、光洁无凹坑和气泡。

整块平板厚薄均匀，一般厚度在3mm，但MH平板的厚度不得小于4mm。

斜面的长度不得超过试管长度的2／3。

应经常观察贮存培养基的质量是否合格。

若试管内液体培养基液面降低，表明水分蒸发，培养基浓缩。

当固体培养基发生颜色改变，表面干燥，出现裂纹或边缘的琼脂与平板或试管分离时，应不再使用。

培养基的pH是细菌生长的重要条件之一，一般而言合格培养基的pH应在规定值上下0.2的范围之内。

2、无菌试验

新制备的培养基，要按批号随机抽取一定数量的样品作无菌试验。

对于压力蒸气灭菌后倾注的固体培养基，抽样后放35℃±1℃温箱培养24-48h；灭菌后经无菌操作分装的液体培养基，要全部放入35℃±1℃温箱内培养24h；对有些无需高压灭菌，只需煮沸消毒的选择性培养基要取部分琼脂，放入无菌肉汤管培养24h；上述试验证实无细菌生长时才算合格。

若有细菌生长，说明培养基制备过程中已受杂菌污染，除了寻找原因外，应不再使用。

3、细菌生长试验

所有的培养基在使用前除了做无菌试验外，还必须做细菌生长试验以测定培养基性能是否符合要求。

要用已知的标准菌株，按照NCCLS推荐的方法作质控。

质控所需的标准菌株分2种：

一种是已知的可在某种培养基上生长，并产生典型生物学性状的，对培养基中的某种物质产生阳性反应的菌株；另一种是用已知的不能在某种培养基上生长，或对培养基中的某种物质产生阴性生化反应的菌株。

表2列出10种常用固体培养基的质量鉴定标准及所需标准菌株。

无论是厂家的成品培养基，还是实验室自制的培养基，都应经过上述三方面的检验，才能证实其质量是否合格。

厂家应将所做的试验内容，形成书面的质量鉴定送交客户保存。

实验室自行配制过程中应对上述鉴定内容有明确记载。

此外，还应对培养基配制原料的性状、批号、失效期，以及配制过程各个环节的操作形成记录。

常用培养基的质量鉴定见下表。

表210种常用培养基的质量鉴定表

培养基名称

质控菌株

ATCC

鉴定标准

血平板

金黄色葡萄球菌

化脓性链球菌

肺炎链球菌

大肠埃希菌

25923

19615

6305

25922

中度到大量生长

生长，β-溶血

生长，α溶血

生长

巧克力平板

流感嗜血杆菌

脑膜炎奈瑟菌

淋病奈瑟菌

10211

13090

43096

生长

生长

生长

伊红美蓝平板

鼠伤寒沙门菌

大肠埃希菌

粪肠球菌

14028

25922

29212

生长，无色到琥珀色菌落

生长，蓝黑菌落，金属光泽

部分抑制

麦康凯平板

大肠埃希菌

奇异变形杆菌

鼠伤寒沙门菌

粪肠球菌

25922

12453

14028

29212

生长，红色菌落

生长，无色菌落，迁徒现象部分抑制

生长，无色菌落

部分抑制

SS平板

鼠伤寒沙门菌

福氏志贺菌

粪肠球菌

大肠埃希菌

14028

12022

29212

25922

生长，无色菌落，有或无黑心

生长，无色菌落

全部抑制

部分或全部抑制

TCBS平板

霍乱弧菌

副溶血弧菌

大肠埃希菌

9459

17802

25922

生长，黄色菌落

生长，蓝色菌落

部分或全部抑制

营养琼脂平板

沙保弱平板

福氏志贺菌

白色念珠菌

大肠埃希菌

12022

10231

25922

中度到大量生长

生长

部分或全部抑制

罗氏培养基

结核分枝杆菌H37Rａ

大肠埃希菌

25177

25922

生长

部分或全部抑制

淋病选择性

培养基

淋病奈瑟菌

奇异变形杆菌

表皮葡萄球菌

43096

43071

12228

生长

部分抑制

部分抑制

常用培养基、染色液及生化反应的种类繁多，其相应的质控菌株也有数十余种，这些菌株应来源于世界上专门保存菌种的权威机构。

如美国菌种保藏中心（ATCC）；英国的国家典型菌种保藏中心（NCTC）；或我国卫生部药检生物制品检定所菌种保藏中心（CMCC）等。

下面介绍一下质控菌株的保存方法

（1）一般保存方法：

用高层琼脂保存，使细菌处于代谢缓慢状态，并按照各种细菌生长的情况作定期移种。

此方法是最简单的保存方法，最长可保存一年细菌不会死亡。

但细菌经多次移种后，性状可能发生变异。

（2）低温冰箱保存方法：

取数环对数生长期的细菌混悬于小牛血清或无菌脱纤维羊血0.5－1ml中，容器中加入无菌玻璃珠数枚，速冻后（液氮内），贮存于－40℃低温冰箱中保存。

需用时无菌镊子取出一枚玻璃珠置培养基中，即可获得新鲜菌种。

这种方法可长期保存细菌。

　　（3）真空冷冻干燥法：

该方法最为可靠，具有不改变菌种性状，可长期保存，对保存条件适应性强等优点。

（五）试剂质控

临床微生物实验室常用的试剂，包括染色液、诊断血清及各种生化反应试剂等。

各种染色液配制后，必须用适应的标准菌株作阳性和阴性对照后方可使用；各种生化反应试验的培养基及试剂，必须用化学纯或分析纯试剂配制，并且阳性与阴性菌株作性能试验，再注明批号，按试剂性质，分别予以避光冷藏，在有效期限内使用；定期以阳性与阴性菌株进行监控。

1、染色液质控

细菌室最常用的染色液是革兰染色液和抗酸染色液。

对自制的染色液，要求将整个配制过程的操作步骤形成记录并保存；配好的染色液应贴上写有染色液名称、配制日期、配制人的标签；初次使用时必须用革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌标准株作质量鉴定，以证实染色液配制无误；商品化染色液应对试剂名称、批号、存放条件、失效期等说明；厂家应向客户提供染色液鉴定的质量保证书。

按照CLIA88的规定，染色液应每周作一次质量控制，用金黄色葡萄球菌（ATCC25923），大肠埃希菌（ATCC25922）作革兰染色液的室内质控。

用结核分枝杆菌H37Ra（ATCC25177）对抗酸染色液进行质量鉴定。

过期的染色液应不再使用。

2.、常用生化试剂的质控

随着细菌鉴定仪和快速微量生化鉴定板条的普及，临床微生物检验常用的生化试剂种类日趋减少，对这些试剂的质控要求见表3。

此外，应注意在用试剂贮存时的避光、冷藏等要求，保证试剂的稳定性。

不要使用过期的试剂。

3、诊断血清的质控

诊断血清是一种重要的细菌鉴定的试剂，应从有资质的生产单位购买。

验收时必须看清生产批号、血清效价、透明度与色泽。

初次使用时应注意：

工作浓度并与原用的诊断血清对照比较后再用于病人样品的测试。

试验中应注意无菌操作，避免细菌污染。

要经常检查贮存在4℃冰箱中的各种血清，若发现混浊，出现絮状，应停止使用。

为保证血清凝集反应结果准确，应每3个月对血清进行一次质控；不要使用过期的血清。

表3常用试剂的质量鉴定

试剂名称

阳性对照菌种

阴性对照菌种

监控频率

凝固酶血浆

金黄色葡萄球菌

表皮葡萄球菌

每天

杆菌肽

A群链球菌

B群链球菌

每周

Optochin纸片

肺炎链球菌

每周

10%去氧胆酸钠

肺炎链球菌

每周

三氯化铁（马尿酸钠试验）

B群链球菌

A群链球菌

每次

过氧化氢

金黄金葡萄球菌

A群链球菌

每天

氧化酶

铜绿假单胞菌

大肠埃希菌

每天

甲基红试剂

大肠埃希菌

产气肠杆菌

每周

VP试剂

产气肠杆菌

大肠埃希菌

每周

三氯化铁（苯丙氨酸脱氢酶试验）

奇异变形杆菌

大肠埃希菌

每周

“X”因子条状物

嗜沫嗜血杆菌

副流感嗜血杆菌

每周

“V”因子条状物

副流感嗜血杆菌

流感嗜血杆菌

每周

“X+V”因子条状物

流感嗜血杆菌

副流感嗜血杆菌

每周

芽管血清

白色念珠菌

热带念珠菌

每次

微生物室标本接收程序（SOP）

一、目的：

确保送检标本合格及检验结果的正确性和及时性。

二、操作方法

1．接收标本应做好查对，对不合格标本或标本与检验单不符合的，应及时与临床联系，直至标本送检合格并做好记录。

⑴痰液标本：

先看外观（脓性粘液状），再直接涂片镜检，低倍镜下白细胞＞25个、上皮细胞＜10个/每个视野，为合格痰液；应无菌容器盛装。

⑵无菌体液标本：

检查盛装器皿或试管必须消毒灭菌，标本数量多少是否符合要求，是否有污染的可能；尽量在用药前采集标本。

⑶大便标本：

要取病变部位（脓、血粘液）盛装消毒盒内；容易干燥的标本：

如咽拭子、脓液拭子、泌尿生殖道拭子等采集后要及时送检、接种。

⑷尿液标本：

要留取晨尿3-5ml于无菌瓶中，防止污染；厌氧菌培养的标本，其送检环境是否满足；各种标本做好原始单的登记。

2．标本编号规则

（1）BacT/ALERT3D60型血培养编号按流水号+位置号。

（2）接种平板常规标本按流水号，每年从1开始编号。

（3）标本涂片编号：

①涂片查找抗酸菌：

T+编号；

②涂片找真菌、杆菌：

B+编号；

③球菌涂片：

C+编号。

（4）院感标本按每月从1编号。

3．标本登记规则

⑴细菌室要有细菌培养登记本、传染病登记本、各种涂片染色登记本，并在电脑上登记每天接受的标本，和细菌培养鉴定及药敏资料。

⑵登记内容必须完整准确，包括编号、患者姓名、性别、年龄、科室、床号、标本来源、住院号、细菌名及各种药敏结果。

⑶对法定传染病的结果，要登在传染病登记本上，并报告院防保科。

⑷各项登记必须准确登记年、月、日，方便查询。

⑸对有特殊耐药机制的细菌，必须准确记录其产酶结果。

微生物室标本接种程序（SOP）

一、目的：

保证标本正确接种到合适的培养基中，使细菌能得到充分的生长和能分离出单个菌落，获得纯培养而供分析鉴定。

二、操作方法

1、右手持接种工具，在火焰上烧灼接种环变红而灭菌。

2、左手持标本容器或试管，用接种环挑取标本，采用分段划线法接种于平皿上；无菌组织来源的标本应接种增菌液，放35℃培养箱中。

当从标本器皿或平板上挑取菌落后，应立即塞上试管塞或扣上平皿盖以防污染。

3、挑取标本时，应注意选择反映感染的病理部分。

如粪便挑取粘液脓血部分；纯化细菌应从原代培养基上挑取单个可疑菌落；从液体培养基中取菌，将接种环在培养液中蘸取一环即可，并编号记录。

4、接种时可根据标本，以快速、提高阳性率为前题，采用不同的接种方法，选择不同的培养基。

5、接种后，应在火焰上烧灼接种工具，所用工具应放回原处。

6、下表1是各种标本细菌培养应选择的培养基。

如尿液接种方法：

在火焰上烧红接种环，无菌手续挑取中段尿50ul，在血琼脂平板和麦康凯平板中做分段划线接种，放35℃培养箱中培养。

表4各种标本选择的培养基

标本名称

接种培养基

尿液

血平板（BM）、麦康凯（MCK）

粪便

麦康凯（MCK）、血平板、SS

痰液、咽拭子、灌洗液

血平板、巧克力平板、麦康凯（MCK）

痰液、白带等检验真菌

沙保罗培养基、血平板

白带、前列腺液

巧克力平板（TM）、血平板

伤口分泌物、脓汁

血平板、麦康凯（MCK）

血液、脊髓液

专用血培养瓶

脑脊液

巧克力平板、血平板、肉汤管

注：

巧克力平板接种后放入5%-10%CO2环境中35℃培养中培养。

血培养瓶包括PLUS+AEROBIC/F（细菌、真菌培养）

PLUS+ANAEROBIC/F（厌氧菌培养）

PEDC-PL