细胞增殖实验.docx

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细胞增殖检测方法

细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。

目前细胞增殖检测主要分为五类：

DNA合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP浓度检测。

在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。

1.DNA合成检测

这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。

该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。

该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。

不过，可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。

但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。

该方法的优点就是不再需要放射性物质。

BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。

2.代谢活性检测

检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。

在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或AlamarBlue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。

可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。

四种最常见的四唑盐是：

MTT、XTT、MTS和WST1。

MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。

因此，MTT主要作为终点检测方法。

其他三种盐与AlamarBlue一样，都是可溶且无毒。

它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。

其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；AlamarBlue的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。

四唑盐和AlamarBlue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。

它们适用的检测仪器包括：

标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪等。

3.活细胞数量

最直接的增殖指标是活细胞数量的变化。

但细胞直接计数法操作繁琐费时，所需细胞量较多，不推荐使用。

4.增殖标志检测

有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增殖细胞缺乏这些抗原，因此可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。

例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期（增殖期）表达，而在G0期和G1期（非增殖期）不表达。

用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增殖情况。

由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。

不过这一方法颇受肿瘤研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。

其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括：

增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB，以及磷酸化组蛋白H3等。

5.ATP检测

细胞内的ATP含量受到了严格调控，检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。

死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。

利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础，能够提供非常灵敏的结果。

如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。

这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。

选择策略

怎样选择最适合的检测方法，主要依赖于使用的细胞类型和具体研究方案，还取决于实验者在细胞增殖中期望得到的信息。

假如希望了解细胞增殖中的代谢活性变化，可以使用四唑盐和比色法检测；如果关注重点在于对DNA合成的改变，可以选择用BrdU或EdU标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析；若研究的是单个细胞，也可以用BrdU或EdU标记来检测DNA合成，将其与荧光标记的相应抗体结合，就可以通过流式细胞仪来进行流式分选。

应该注意，测定细胞增殖很多时候单一方法都是有缺陷的，四唑盐—MTT法不够精确；最直接的指标是活细胞数量的变化，结果比较准确，但细胞直接计数法所需细胞量较多，操作繁琐费时；而3H掺入法麻烦且不安全。

所以，建议最好用两种以上的方法进行测定，这样做主要是可以有一个用于辅助修正的数据。

EdU实验流程

一、实验原理

EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

二、材料及准备工作

试剂、耗材名称

品牌

货号

Cell-Light™EdUApollo®567InVitroImagingKit（500T）

广州锐博

C10327-1

细胞培养板或培养皿

☆试剂盒需4˚C储存，荧光试剂请避光，勿冻存，可稳定储存一年

溶液配制

1.PBS（pH7.2~7.6）

PBS缓冲液10x

NaCl80g

KCl2g

Na2HPO4·12H2O36.151g

（OrNa2HPO414.4g

K2HPO42.4g

蒸馏水至1000mL调pH值至7.4

2.渗透剂（含0.5%TritonX-100的PBS）

3.甘氨酸溶液（2mg/mL）（去离子水配配制，现用现配）

4.细胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS）

多聚甲醛4g

1xPBS定容至100ml，磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下。

如仍不溶，滴加NaOH（1N或0.1N），调PH值至7.4。

5.1%BSA的PBS

6.甲醇

7.无水乙醇

三、操作步骤及注意事项

A流式检测

1.样本制备

1.1取对数生长期的细胞，105细胞接种于6孔板或培养皿中，培养箱中培养过夜；

1.2可以根据实验需要进行各种药物处理。

2.EdU标记

2.1用细胞培养液以1:

1000的比例稀释EdU溶液（试剂A），制备适量50µMEdU培养基；

2.2每孔加入500µL50µMEdU培养基孵育2h。

（☆此步务必在超净台内完成）

3.细胞固定

3.1用0.25％胰酶进行消化，转至离心管，用1×PBS吸打后，1000rpm×5min，弃上清；

3.2用含1%BSA的PBS吸打后，1000rpm×5min，弃上清；

3.34%多聚甲醛的PBS固定15min，1000rpm×5min，弃上清；

3.4用含1%BSA的PBS吸打后，1000rpm×5min，弃上清；

3.5300µLPBS吹散细胞，加入700µL无水乙醇（制成70%乙醇PBS液），边加边震荡混匀，4℃固定24h以上；

3.61000rpm×5min，弃上清。

4．EdU反应

4.1按下列顺序配置适量1×Apollo®反应液（☆现用现配，30分钟用完，以免破坏正常的反应体系）：

4.2加入500µL的1×Apollo®染色反应液，重悬细胞，避光室温孵育30min，1000rpm×5min；

4.3加入500µL0.5%TritonX-100的PBS吸打，1000rpm×5min，重复2次；

4.4每孔每次加入100µL甲醇冲洗1次，每次5min；PBS100µL脱色摇床5min。

5.染色

5.1用去离子水按100:

1稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；

5.2弃上清，加入500µL1×Hoechst33342反应液，避光室温孵育30min，1000rpm×5min；

5.3加入500µLPBS吸打，1000rpm×5min，重复2次，洗脱Hoechst33342反应液。

6．流式分析

6.11000rpm×5min收集细胞，300µLPBS吹散细胞，自备300目尼龙滤膜过滤（若吹打成单细胞悬液，可不过网）；转至流式管进行流式细胞仪分析，荧光通道依据实验仪器而设定。

B荧光显微镜检测

1.样本制备

1.1取对数生长期的细胞，4×103~1×105细胞接种于96孔板中（☆细胞接种密度，没有严格要求，只要不影响显微镜下观察即可），培养箱中培养过夜；

1.2可以根据实验需要进行各种药物处理。

2.EdU标记细胞

2.1用细胞培养液以1:

1000的比例稀释EdU溶液（试剂A），制备适量50µMEdU培养基；

2.2每孔加入100µL50µMEdU培养基孵育2h。

（☆此步务必在超净台内完成）;

2.3弃培养液，100µLPBS清洗细胞2次，脱色摇床上，每次5min。

3.细胞固定化

3.1每孔加入100µL4%多聚甲醛的PBS，室温脱色摇床孵育30min；

3.22mg/mL甘氨酸脱色摇床孵育5min；（☆可在多聚甲醛固定时配置，现用现配。

目的：

中和多聚甲醛）

3.3每孔加入100µLPBS脱色摇床孵育每次5min；

3.4每孔加入100µL0.5%TritonX-100的PBS，脱色摇床孵育10min；

3.5每孔加入100µLPBS脱色摇床孵育1次，10min。

4．EdU反应

4.1按下列顺序配置适量1×Apollo®反应液（☆现用现配，30分钟用完，以免破坏正常的反应体系）：

4.2每孔加入100µL的1×Apollo®染色反应液，避光，室温脱色摇床孵育30min；

4.3每孔每次加入100µL渗透剂（0.5%TritonX-100的PBS）脱色摇床孵育2次，每次10min；

4.4每孔每次加入100µL甲醇冲洗1次，每次5min；PBS100µL脱色摇床5min。

5.染色

5.1用去离子水按100：

1稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；

5.2每孔加入100µL1×Hoechst33342反应液，避光，室温脱色摇床孵育30min；

5.3每孔每次加入100µLPBS脱色摇床孵育2次，每次5min，洗脱Hoechst33342反应液。

6．图像获取及分析

6.1建议染色完成后，立即进行观测，因易淬灭，曝光时间建议＜30ms；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不要超过3天。

☆特别注意

1、Apollo染色反应液一定要现用现配，按顺序加样，小心称量试剂E，注意避光。

试剂E易氧化，用毕请立即盖紧瓶盖。

若发现试剂E粉末变黄，极可能是发生了氧化失效。

2、EdU的使用浓度，用50µM的较多，可以在10-50µM间选择合适条件。

3、EdU荧光极易淬灭，请染色后立即送检或镜下观察。

附：

EdU与BrdU实验步骤比较

EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速统计处于S期的细胞百分数来检测细胞DNA复制活性。

适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

1.EdU的荧光染料是小分子物质（0.6×103），相对于BrdU抗体这样的大分子物质（150×103）来说能够轻松地透过膜结构，这种能够有效快速地扩散和穿透组织的能力使得大的组织和器官碎片标本的快速处理成为可能。

2.这种小分子化学反应检测方法反应快，效率高，反应时间仅需几分钟，相比BrdU检测需要抗原抗体过夜孵育，EdU检测只需要2.5个小时。

3.EdU在检测掺入DNA分子中的乙炔基与小分子荧光叠氮化合物反应时不需要进行DNA变性处理（酸解、热解、酶解等），有效保证了DNA双链结构的完整性,避免样品损伤。

不会像BrdU标记检测那样影响细胞核的复染，也不会破坏细胞的形态学特征以及细胞核抗原的识别位点。

因此，EdU检测技术就可以与包括细胞周期分析在内的其他DNA染色相结合，并且很好地相容。

这种简单化的处理方式同样有助于在组织器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，使其具有更高的敏感度和更快的检测速度。

4.EdU标记可以通过结合其他抗体标记等技术，对细胞表面或细胞内特异性标志物进行多重检测和多参数分析，在细胞水平进行系统性定量检测，直接获取细胞多维信息，深入开展细胞增殖、细胞周期、细胞毒性、DNA复制及修复、信号通路等方面的研究。

5.不同于BrdU标记检测技术那样依赖于抗原抗体的结合，EdU检测中形成的这种特殊的生物合成物（稳定的三唑环）无需抗原抗体反应，有效地降低了背景的干扰，并显著提高了检测的灵敏度。

6.BrdU需要DNA变性后才能与抗体结合，导致BrdU、Hoechst染色弥散，边缘模糊不清；而EdU边缘清晰完整，检测更灵敏、更准确；Apollo染料分子很小，能够轻松地透过膜结构，无需DNA变性即可与EdU特异结合发光，而且不会影响其与其它染料的结合，能够准确进行DNA定量。

EU是尿嘧啶的类似物，同样通过“click”化学反应能够标记上荧光。

所不同的是EU是在细胞转录合成RNA的时候掺入到RNA里面。

所以用这个技术能够染出目标细胞新合成的RNA，从而达到检测细胞活性、毒性、RNA转录定位、RNA分布检测及RNA与蛋白的相互作用（此项需结合免疫荧光技术使用）等研究的目的，同样有高精度、高灵敏度、操作简单方便等诸多优点。

EU是研究细胞活性、毒性及RNA转录情况和机制等的理想工具。

MTS检测细胞增殖实验

一、实验原理

本试剂盒是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的检测试剂。

此试剂含有一个新型的四唑化合物[3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium,innersalt;MTS（a）]和一种电子偶联剂（phenazineethosulfate;PES）。

PES具有增强的化学稳定性，这使它可与MTS混合形成稳定的溶液。

MTS（Owen’sreagent）被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，可直接溶解于培养基中（图1）。

这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的NADPH或NADH的作用下完成的。

检测时，将少量的CellTiter96®AQueousOneSolutionReagent直接加入培养板孔的培养基中，孵育1–4小时，在490nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。

二、材料及准备工作

试剂、耗材名称

品牌

货号

CellTiter96®AQueousOneSolutionCellProliferationAssay

Promega

G3581（5000T）

96孔细胞培养板

☆特别注意

1.–20°C避光长期储存；频繁使用时4°C避光保存6周。

注意：

实验证明此试剂冻融10次后与新鲜的试剂使用效果相同；

2.此物质的化学、物理和毒理学性质还未完全研究清楚，因此建议在使用此试剂时带手套，穿实验服并带护目镜；

3.CellTiter96®AQueousOneSolutionCellProliferationAssay是光敏感试剂，装在琥珀色的容器中。

试剂暴露在光线下数小时后可能会发生褪色。

这种褪色反应可能会导致490nm的背景吸光值轻微升高，但不会影响检测结果。

实验准备

1.多道加样器（排枪），或连续式加样器；

2.酶标仪。

三、操作步骤及注意事项

1.样本制备

1．取对数生长期的细胞，以5×103细胞接种于96孔板中作为增殖研究的起始细胞数。

或根据实验细胞的增殖曲线选择合适的接种密度；

☆由于最外缘培养孔中培养基的挥发较强，尽量避免在其中种入细胞，并且最好能够在其中加入一定量培养基保证中间孔不会产生过度挥发。

2．可以根据实验需要进行各种药物处理。

2.试剂准备

2.1室温静止90分钟或37°C水浴10min，使CellTiter96®AQueousOneSolutionReagent融化。

3.反应及检测

3.1在96孔板中，每孔100ul培养基加20µlCellTiter96®AQueousOneSolutionReagent；

☆推荐以排枪或连续式加样器及数字式加样器加试剂，以保证加样方便准确

3.2在37°C，5%CO2的环境下孵育1-4h，通常2h为；

☆如果立刻检测就直接进行后续步骤，如果需要以后检测，每孔加入25μl10%SDS终止反应，避光保存于室温的湿盒中，最多可保存18h，然后再继续。

3.3酶标仪490nm读取吸光度值。

☆特别注意

1.读取波长选择：

图2显示MTS还原后产生的甲臜产物的吸光度光谱。

推荐在吸收峰490nm读取数据。

如果酶标仪没有490nm的滤片,可以在450–540nm范围内读取数据。

如果需要，可以在其它波长读取吸光度值，但检测灵敏度会降低。

在630–700nm范围的参考波长可以用来减去细胞碎片过多造成的背景值，以及其图2.MTS四唑化合物还原后产生的甲臜产物的吸光度光谱在490nm显示最大吸光值。

负吸光值（382nm）对应的是MTS的消失（转化成甲臜产物）。

它非特异性吸光度值。

2.490nm的背景吸光度值校正:

在以MTS试剂孵育后，细胞培养基中会在490nm有微量的自发产生的吸收光。

使用的细胞培养基种类，血清种类，pH和暴露在光线下的时间长度都可能会影响490nm的背景吸光度值。

孵育4h后，背景吸光度值通常在0.2–0.3。

背景吸光度可能受某些带四唑还原反应的化合物的影响。

强还原物质，包括维生素C,或含巯基的化合物,如谷胱甘肽，辅酶A和二硫苏糖醇,能够以非酶的方式还原四唑盐，从而导致背景吸光值的增加。

高pH的培养基或长时间暴露在直接光照下面也可能导致自发的四唑盐还原反应的加速进而导致背景吸光值的增加。

如果使用含酚红的培养基，快速的颜色变化可能指示待测化合物引起的pH值变化。

待测化合物产生的特异的化学干扰可以通过检测对照孔（含有不同浓度待测化合物的培养基，但是不含细胞）的吸光度来确定。

490nm的背景吸光度值可用下述方法校正：

准备3个重复的无细胞对照孔，含有与实验孔同样体积的细胞培养基和CellTiter96®AQueousOneSolutionReagent。

从所有其它孔的吸光值中减去“无细胞”对照孔在490nm的吸光度平均值，即可得到校正的吸光度值。

3.细胞增殖实验至少设3个复孔，连续监测5-7天。

以细胞贴壁后记为时间0点进行检测第一次检测，而后每24h进行一次检测，孵育时间保持一致。

4.淋巴细胞检测：

淋巴细胞产生的甲臜比其它类型的细胞要少，为了得到更显著的吸光度值变化，需增加细胞数至约2.5–10×104细胞/孔，并在加入MTS试剂后孵育培养板至最长的4小时。

5.试剂优化：

如果使用不同体积的培养基,可以根据20µl试剂/100µl培养基的比例调整。

这个试剂:

培养基比值产生的MTS终浓度为317µg/ml/实验孔。

对于不同的细胞系，最适的四唑盐和电子偶联剂的浓度可能会有微小的变化，但检测灵敏度很少受到影响。

6.细胞数优化：

不同类型的细胞，代谢活性不同。

影响细胞代谢的因素也会影响细胞数和吸光值的关系。

黏附依赖性细胞在高细胞密度时会产生接触抑制，进而代谢活性降低，导致细胞数和吸光度值的非线性关系。

影响细胞质体积或细胞生理状态的因素也会影响代谢活性。

对大多数肿瘤细胞，杂瘤细胞和纤维母细胞系，推荐5,000cells/孔作为增殖研究的起始细胞数，虽然少于1,000个细胞通常也可被检测。

血淋巴细胞例外，一般需要25,000–250,000细胞/孔才能获得足够的吸光度值。

四、结果判定

附：

代谢活性检测

3H-胸腺嘧啶核苷掺入法（3H-TdR）

胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA合成的前体物，处于S期的细胞不断摄取TdR用以合成DNA。

3H-TdR掺入法是将被放射性标记的3H-TdR掺入处于DNA合成期的细胞内，3H-TdR掺入量的多少可客观反映细胞复制DNA能力的大小从而间接了解细胞增殖情况，用液体闪烁计数仪检测出3H放射活性即可反映DNA含量。

优点：

该法对各种动物肿瘤及人类肿瘤均有较好的预测价值和重复性。

缺点：

操作复杂，试剂含有放射性同位素，对实验者有一定的危害，限制了其应用。

四甲基偶氮唑盐法（MTT）

MTT商品名为噻唑蓝，是一种黄色的染料，其原理为：

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶-甲瓒（formazan），并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值可间接反映活细胞数量，在一定细胞数量范围内MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

优点：

简便灵敏且无放射性。

缺点：

MTT溶液需要放置在4℃，避光保存，最好是现用现配；由于MTT经还原所产生的产物甲瓒不溶于水无法直接测定吸光度需要被溶解之后才能检测，这不仅使工作量增加，而且MTT溶液具有致癌性；MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，不能测定细胞的绝对数；过氧化物会降低MTT测定的准确度，抑制将近95%的MTT与O2-的反应；MTT溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上而致使检测的结果呈现假阴性。

二甲氧唑黄比色法（XTT）

XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞还原形成水溶性的桔黄色的甲瓒产物，不形成颗粒，可直接用酶联免疫分析仪检测吸光度从而检测细胞增殖及活性。

加上电子偶合剂如硫酸酚嗪甲脂（PMS）后可大大提高XTT的检测效率。

优点：

XTT比色法XTT法省去了溶解还原产物结晶的步骤，故较MTT法更加快速简便敏感。

缺点：

XTT水溶液不稳定，需要低温保存，现配现用；由于XTT的代谢产物呈桔黄色，故培养体系中有些黄色代谢物和试剂可能会影响其检测结果；与MTT一样，过氧化物可抑制近95%的XTT与O2-的反应，故对XTT测定的准确度有一定的影响。

内盐法（MTS）

MTS是一种新型的MTT类似物，在偶联剂PMS存在的条件下可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关，可用酶标仪检测。

优点：

无放射性，快速安全，方便灵活，特异性强，克服了MTT、XTT的缺点，比MTT法更加准确。

缺点：

在96孔板试验中，最外侧的一圈孔内液体易蒸发，对检测结果有一定影响；不适合于淋巴细胞促有丝分裂反应的检测。

四唑单钠盐法（WST-1）

WST-1是一种