第七节高效液相色谱.ppt

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高效液相色谱法,22:

02,1,高效液相色谱简介,20世纪初：

俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。

经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色谱。

20世纪60年代末：

随着色谱理论的发展、高效细微固定相的开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用，高效液相色谱法得到了突破性的发展。

高效液相色谱是在经典液相色谱的基础上，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了高效分离和自动化操作。

22:

02,2,22:

02,3,高效液相色谱法和经典液相色谱法对比,采用颗粒极细、规则均匀的固定相，传质阻力小，分离效率高,HPLC特点,高压：

流动相流经色谱柱时，受阻力较大，为了迅速通过色谱柱，HPLC使用高压输液泵对流动相加高压，压力可达40-50MPa。

高效：

分离效能高，柱效达40000-60000块/m。

应用范围广：

约适用于80%的有机物，特别是高沸点、大分子、热稳定性差的有机化合物。

速度快:

流动相速度110ml/mim,通常分析一个样品在1530min，有些样品甚至在5min内即可完成。

分辨率高:

可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高:

紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。

柱子可重复使用:

用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少:

几微升至几十微升重复性好,22:

02,4,22:

02,5,高效液相色谱法和气相色谱法对比,流动相选择范围,分离过程样品状态,色谱柱柱温,分离对象性质,流动相不同,22:

02,6,高效液相色谱法和气相色谱法对比,流动相及选择范围、样品状态、色谱柱温、分离对象,高效液相色谱法局限性,成本高易污染环境不能代替气相色谱，无法完成柱效高达10万块理论塔板数的分析,22:

02,7,液相色谱分类,按分离原理分类：

吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法体积排阻色谱法按固定相形式：

柱色谱法纸色谱法薄层色谱法按固定相种类：

液固色谱液液色谱键合相色谱硅胶为填料的液固色谱和以硅胶为基质的键合相色谱应用最广,22:

02,8,液固色谱法分离机理：

固定相是固体吸附剂，流动相中各组分对固定相的吸附能力不同，使各组分在固定相中保留不同而实现分离,22:

02,9,1）固定相极性：

硅胶、氧化镁、氧化铝等非极性：

活性炭、碳多孔微球等2）流动相弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物。

如：

正构烷烃（己烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等流动相选择原则：

极性大的试样选择极性较强的流动相，极性小的试样则选用低极性流动相。

必要时可采用混合溶剂或梯度洗脱。

3）应用中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃等不同极性取代基的化合物结构异构体和几何异构体混合物的分离,22:

02,10,22:

02,11,液液分配色谱法固定相（机械吸附在惰性载体上的液体）与流动相均为液体但互不相溶，极性相差大，对待测组分溶解度都足够大（待测组分在固定相的溶解度要大些）基本原理：

试样溶于流动相后，在色谱柱内经过两相分界面进入固定液中。

由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而组分在两者间进行分配，根据组分在两相中分配系数的不同实现分离。

液一液分配色谱法与气一液色谱法的比较：

相似处：

分离顺序决定于分配系数的大小，K大的组分保留值大。

不同处：

GC流动相性质对K影响不大，而LC中流动相种类对K影响较大。

分配色谱按固定相和流动相极性分为正相色谱:

固定相载体上涂布极性固定液,流动相是非极性溶剂,可分离极性较强的水溶性样品,弱极性组分先出峰反相色谱:

固定相载体上涂布非极性或弱极性固定液,流动相是极性溶剂,可分离非极性和弱极性的样品,强极性组分先出峰液液分配色谱固定相固定液易流失,重现性差,不能进行梯度洗脱，使用局限,22:

02,12,化学键合相色谱法将各种不同有机基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。

作用机理：

分配+吸附化学键合固定相具有如下优点：

柱效高：

传质速度比一般液体固定相快；稳定性：

耐溶剂冲洗，无固定液流失，色谱柱的稳定性好、柱效高、寿命长；应用范围广：

改变键合有机分子的结构和基团的类型，能灵活地改变分离的选择性，适用于分离几乎所有类型的化合物；且能用各种溶剂作流动相（梯度洗脱）。

22:

02,13,22:

02,14,化学键合相色谱固定相,化学键合固定相:

a.硅氧碳键型：

SiOCb.硅氧硅碳键型：

SiOSiCc.硅碳键型：

SiCd.硅氮键型：

SiN,疏水基团如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。

正相和反相键合色谱法,离子对色谱,1.基本原理将一种或数种与样品离子电荷（A+）相反的离子（B-）（称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中性缔合物）的分离方法。

多为反相离子对色谱2.固定相、流动相和离子对试剂固定相:

多为C18,C8反相键合相流动相:

以水为主的缓冲液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶剂离子对试剂：

四丁基铵正离子、十六烷基三甲基铵正离子，ClO4-，十二烷基磺酸根等,应用,有机酸、有机碱特别是强酸强碱的分析，如羧酸、磺酸、胺类、酚类、药物、染料等,反相离子对色谱分析有机酸固定相：

C18烷基键合相流动相：

0.03mol/L四丁基铵+戊醇1.4-氨基苯甲酸；2.3-氨基苯甲酸；3.4-羟基苯甲酸；4.3-羟基苯甲酸；5.苯磺酸；6.苯甲酸；7.甲苯-4-磺酸,体积排阻色谱固定相：

凝胶（具有一定大小孔隙分布），表面惰性、含许多尺寸不同的孔穴或立体网状结构分离原理：

按分子尺寸大小和形状不同进行分离的一种液相色谱法。

当被测组分随流动相通过凝胶色谱柱时:

尺寸大于孔径的组分分子不能渗入凝胶孔隙而被全部排斥，最先流出色谱柱尺寸小于孔径的分子则全部渗入空穴，最后流出尺寸中等分子部分渗入较大空穴，而排斥较小空穴。

因此介于中间流出。

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02,19,分类：

软质凝胶凝胶过滤色谱以水溶液作流动相硬质凝胶凝胶渗透色谱以有机溶剂作流动相硬质凝胶应用更为广泛应用：

分离相对分子质量大于2000的化合物；分子质量相差较大的低聚物和小分子化合物,22:

02,20,高效液相色谱仪仪器组成HPLC主要有高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统和数据处理系统和相关辅助部件组成。

21,22:

02,贮液罐用于存放溶剂，材料要耐腐性，对溶剂惰性常用1-2L玻璃瓶，也可用不锈钢、氟塑料制成贮液罐应配有溶剂过滤器，以防止流动相中颗粒流入泵中贮液罐放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，防止溶剂挥发引起流动相组成改变,高压泵,高压方式输送流动相，提供的压强150450Kg/cm2，流量0.110ml/min，能连续工作,泵要求：

流量稳定（0.5%），压力平稳无脉动、耐腐蚀、适用于有机溶剂、水和缓冲液、密封性好、泵体易于清洗和维修。

泵有恒流泵和恒压泵两类。

高压输液系统,辅助装置溶剂过滤器：

去除机械杂质和固体颗粒脱气装置：

去除流动相中的各类气体，以保证柱效梯度洗脱装置当样品组成复杂，组分性质差别较大，组分在流动相和固定相中的分配系数差别很大时，导致部分组分不能有效分离、部分组分保留时间过长,可采用梯度洗脱改变溶剂的组成、极性、PH、离子强度，以提高选择性。

通过梯度装置可使两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元三元或四元梯度洗脱。

优点：

改善峰形、提高柱效、分离复杂混合物时能使所有组分都处在最佳的k值范围内、减少分析时间,22:

02,22,梯度洗脱装置低压梯度（内梯度）：

溶剂在常压下混合，再用高压泵输送至柱系统。

简单、经济，只需一个泵，所用溶剂的元数没有限制。

高压梯度（外梯度）：

一般由两台高压泵构成，每台泵输送一种溶剂。

溶剂在混合室混合后，再输入柱系统。

22:

02,23,24,22:

02,隔膜式注射进样器进样、高压进样阀进样隔膜式注射进样器进样可以柱头进样，减小死体积，充分发挥柱子的性能，简单便宜；缺点是高压进样时漏液，会产生误差，隔垫使用次数有限、进样量小、重复性差高压阀进样使用耐高压的六通阀、双路进样阀，操作时先将进样口与定量环连接，用注射器向定量环注入样品液，然后定量环接入流动相管路，流动相将样品带入色谱柱。

六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。

使用部分装液法进样时，要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。

22:

02,25,进样系统,22:

02,26,22:

02,27,色谱柱柱温箱连接管1）色谱柱：

色谱分离的首要任务是选择性能良好的色谱柱能以获得高的分离效率和较短的分析时间

（1）柱材料及规格柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料的其他金属等。

柱长5-50cm,内径1-6mm。

凝胶色谱内径3-12mm;制备柱内径在25mm以上

（2）柱填料：

固定液涂在担体上而成。

担体有表面多孔型、全多孔型。

全多孔微粒担体（粒径5-10um,由10nm级的硅胶微粒堆积而成，又叫堆积硅珠，颗粒小、柱效高、应用较广泛）（3）保护柱长度一般为分析柱1/5。

价格较低。

作用：

阻断、收集来自进样器的机械和化学杂质，延长柱寿命分析50-100次样品，柱压力有增大趋势时需更换保护柱或色谱柱分离度下降时考虑更换,分离系统,22:

02,28,2）柱温控制HPLC分析中，柱温一般为室温或接近室温。

适当提高柱温可改善传质阻力、提高柱效、缩短分析时间。

恒温加热柱温箱柱温设置一般界于室温到60之间3）柱连接方式要求死体积小用窄孔（内径0.13mm）和厚壁（1.5-2.0mm）不锈钢管，以减小柱外死体积,22:

02,29,检测系统,检测器的作用：

将流动相中组分含量的变化变成可测量的电信号，输入记录仪。

要求：

灵敏度高、重复性好、线性范围宽、死体积小、对温度和流量的变化不敏感紫外可见、示差折光、荧光、电化学、蒸发光散射、化学发光检测器等,22:

02,30,22:

02,31,1、紫外光度检测器是LC广泛使用的检测器，适用于80%样品组成:

光源、流通池、记录仪固定波长、可变波长、二极管阵列三种类型。

工作原理：

基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择吸收，组分浓度与吸光度关系遵守光吸收定律。

固定波长检测波长一般固定在245nm和280nm相当于紫外光度计，为了适应高效液相色谱仪的要求:

池体积很小5-10l，光路长5-10mm,结构采用H型可变波长实际就是一台装有流通池的紫外分光光度计或紫外光度计。

能获得被分离组分的紫外光谱。

22:

02,32,紫外检测器特点：

1）灵敏度高，最小检测浓度达10-10g/ml2）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱3）不破坏样品，可用于制备。

缺点：

不适合于对紫外光完全不吸收的试样、需用无紫外吸收的溶剂作流动相。

33,22:

02,光电二极管阵列检测器检测元件：

光电二极阵列，阵列由一系列光电二极管组成，每一个二极管宽50um，各自测一窄段光谱。

普通紫外-可见检测器：

光源发出的光经单色器分光，只让特定波长的光进入流动池二极管阵列检测器：

先让所有波长的光通过流通池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在检测器上被检测，以实际时间瞬时检测在所有波长上的吸光度，得到三维色谱-光谱图，便于定性。

二极管阵列检测器优点：

扫描速度快，数据重现性好，灵敏度高适用于痕量分析可获得三维色谱光谱图。

22:

02,34,22:

02,35,2、荧光检测器原理：

待测物吸收一定波长的紫外光后发射出荧光，在一定条件下荧光强度与浓度成正比，通过测量荧光强度来确定待测物浓度。

实际上是将带有流通池的荧光分光光度计或荧光光度计作为HPLC的检测器选择性检测器，用于本身能够发射荧光的物质或其衍生物能发射荧光的物质。

灵敏度高，10-13g，比紫外吸收检测器约高二个数量级，适合于痕量分析。

22:

02,36,22:

02,37,3、示差折光检测器通过连续测定流通池中纯流动相和含有被测组分的流动相之间折光率的差别，根据不同物质具有不同折光率进行组分检测。

只要组分折光率与流动相折光率不同就能用示差折光检测器进行检测。

对没有紫外吸收的物质如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃都能检测。

优点：

通用性好，可检测的化合物范围广，尤其在尺寸排阻色谱中用很多。

缺点：

最小检测浓度10-7g/ml,灵敏度不高，对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱,22:

02,38,4、电化学检测器利用物质的电学或电化学性质进行分析的检测器。

主要有：

极谱检测器、安培检测器、库伦检测器和电导检测器，前三种统称伏安检测器，以测量电解电流为基础。

电导检测器：

直接测量色谱柱后流出液的电导变化来计算物质的含量。

电导检测器响应受温度影响较大，因此要求严格控温。

一般在电导池中放置热敏电阻器进行监测。

HPLC分析条件的选择,1分离类型的选择样品性质（相对分子量、在水中和有机溶剂中的溶解度、极性和稳定性、化学结构）相对分子量较低，易挥发而且受热又不分解的化合物，可用气相色谱法分离。

相对分子量为200-2000的样品，适用于标准的液相色谱（液液、液固、离子交换色谱等）。

相对分子量大于2000的宜采用尺寸排阻色谱法。

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02,39,22:

02,40,液相色谱分离类型选择参考表溶于水排阻色谱，水为流动相相对分子质量2000不溶于水排阻色谱，非水流动相同系物分配色谱不溶于水异构体吸附色谱样品分子大小差异大排阻色谱反相液-液色谱相对分子质量溶于水，不离解2000排阻色谱，水为流动相碱阳离子交换色谱溶于水，可离解酸阴离子交换色谱溶于水，离子与非离子反相离子对色谱,22:

02,41,2固定相的选择,分离中等极性和极性较强的化合物,分离非极性和极性较弱的化合物,极性键合相,非极性键合相,3流动相的选择试样在流动相中应有适当的溶解度，要能够溶于流动相中，防止在柱子中发生沉淀。

流动相不能影响试样的检测。

尽量使用高纯度试剂，避免流动与固定相发生作用而使柱效下降或损害柱子，流动相粘度较小。

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02,42,高效液相色谱法在职业卫生检测中的应用,22:

02,43,检测物质：

多环芳烃、酚类化合物、脂肪族醛类化合物等,22:

02,44,五氯酚及其钠盐的高效液相色谱法,1原理空气中中五氯酚及五氯酚钠盐用微孔滤膜和乙二醇吸收液串联采样，经C18柱分离，紫外检测器检测，保留时间定性，峰高或峰面积定量。

2仪器2.1大型气泡吸收管。

2.2微孔滤膜：

孔径0.8m。

2.3塑料采样夹：

滤膜直径25mm。

2.4空气采样器：

01.5L/min。

2.5具塞试管：

10ml。

22:

02,45,2.6高效液相色谱仪，紫外检测器，波长300nm；仪器操作条件色谱柱：

250mm4.6mm，5m，C18；柱温：

室温；流动相：

乙腈:

0.01mol/L磷酸溶液80:

20；流量：

1.5ml/min。

3试剂3.1吸收液：

乙二醇，色谱纯；3.2甲醇：

色谱纯；3.3乙腈：

色谱鉴定无干扰杂峰；3.4磷酸（优级纯）溶液：

0.01mol/L3.5标准溶液：

准确称取50gm五氯酚（优级纯），溶于流动性中，定容至10.0ml容量瓶中，此溶液为5.0mg/ml五氯酚标准溶液。

或用国家认可的标准溶液配制。

22:

02,46,4样品的采集、运输和保存现场采样按照GBZ159执行。

4.1短时间采样：

在采样点，将塑料采样夹（在前）和大型气泡吸收管（内装5.0ml吸收液，在后），以1L/min流量采集15min空气样品。

4.2长时间采样：

在采样点，将塑料采样夹（在前）和大型气泡吸收管（内装5.0ml吸收液，在后），以0.51L/min流量采集28h空气样品。

采样后，立刻将微孔滤膜放入大型气泡吸收管的乙二醇中，密闭进出气口，置清洁容器内运输和保存。

室温下可保存8d。

4.3对照试验：

将塑料采样夹和大型气泡吸收管（内装5.0ml吸收液，在后）带至采样点，除不连接采样器采集空气样品外，其余操作同样品，作为样品的空白对照。

22:

02,47,5分析步骤5.1样品处理：

将采样后的吸收液摇匀，吸收液定量转移至具塞试管中，用甲醇洗涤吸收管和微孔滤膜，并定容至10.0ml，摇匀，供测定。

5.2标准曲线的测定：

用流动相稀释五氯酚标准溶液成0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和40.0g/ml标准系列。

参照仪器操作条件，将高效液相色谱仪调节至最佳测定状态，分别进样10.0l，测定各标准系列。

每个浓度重复测定3次。

以测得的峰高或峰面积均值分别对五氯酚浓度（g/ml）绘制标准曲线。

5.3样品测定：

用测定标准系列的操作条件测定样品和空白，测得的样品峰高或峰面积值后，由标准曲线或回归方程得五氯酚浓度（g/ml）。

22:

02,48,6计算按式GBZ159的要求将采样体积换算成标准采样体积。

按下式计算空气中五氯酚的浓度：

10cC=Vo式中：

C空气中五氯酚的浓度，mg/m3；c测得吸收液中五氯酚的浓度（减去样品空白），g/ml；10吸收液的总体积，ml；Vo标准采样体积，L。

时间加权平均容许浓度按GBZ159规定计算。

22:

02,49,7说明7.1本法的检出限为0.04g/ml，最低检出浓度：

0.03mg/m3（以采集15L空气样品计）。

测定范围：

为0.0440.0g/ml。

当样品浓度分别为3.0、20.0、40.0g/ml相对标准偏差分别为3.2、1.0%、0.1。

7.2本法的采样效率：

97。

7.3现场空气中可能共存的六六六、3-氯酚等化合物不干扰测定。

22:

02,50,参考色谱图,22:

02,51,