学年高中生物第一部分微生物的利用第2课时分离以尿素为氮源的微生物同步备课教学案浙科版选修1.docx
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学年高中生物第一部分微生物的利用第2课时分离以尿素为氮源的微生物同步备课教学案浙科版选修1
第2课时 分离以尿素为氮源的微生物
考试要求
知识内容
考试属性及要求
考情解读
分离以尿素为
氮源的微生物
加试
1.进行微生物分离。
使用含有尿素的培养基，采用涂布分离法，分离有脲酶的细菌。
2.使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。
3.说明分离以尿素为氮源的细菌的实验原理。
4.举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌。
一、实验目的、原理、设备、用品及材料准备
1.实验目的
（1）使用专一的培养基（含有尿素）分离专一的细菌（有脲酶的细菌）。
（2）利用指示剂颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应。
2.实验原理
（1）脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。
有一些细菌含有脲酶可以分解尿素，利用尿素作为其生长的氮源。
（2）（NH2）2C＝O＋H2O
2NH3＋CO2
3.设备及用品
灭菌锅或高压锅、250mL的三角瓶1个和100mL的三角瓶2个、封口膜和橡皮圈、培养皿4个、接种环和玻璃刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有盖的试管（15mm×150mm）5支和试管架、移液器。
4.实验材料
（1）在100mL烧杯中装入50mL70%酒精，将玻璃刮刀浸泡在其中。
（2）在100mL三角瓶中配制好25mL全营养LB固体培养基（0.25g蛋白胨，0.12g酵母提取物，0.25gNaCl和0.5g琼脂糖，水25mL），加上封口膜后灭菌待用。
（3）在100mL三角瓶中配制好25mL尿素固体培养基（0.025g葡萄糖，0.12gNaCl,0.12gK2HPO4,0.25mg酚红和0.5g琼脂糖，水15mL），加上封口膜后灭菌，待冷却至60℃时，加入通过G6玻璃漏斗过滤（使之无菌）的10mL尿素溶液（内含2g脲），摇动，混合均匀后待用。
（4）将盛有4.5mL蒸馏水的5支有塞试管灭菌后待用。
（5）在250mL三角瓶中装入99mL蒸馏水，用封口膜盖上，灭菌后待用。
（6）土样1g（从有哺乳动物排泄物的地方取得）。
1.为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？
答案 琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。
如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量非以尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故而用经纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂。
2.分离以尿素为氮源的微生物实验所用培养基为尿素固体培养基。
在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的是尿素，琼脂糖的作用是凝固剂。
3.微生物要利用尿素需要分泌脲酶，不能分泌脲酶的微生物不能利用尿素。
据此该培养基对微生物具有选择作用，其选择机制是只有能够分泌脲酶从而以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。
4.有脲酶的细菌在生态系统稳态中起什么作用？
答案 如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水解，水解后的氨使土壤变成碱性，氨与其他阴离子物质如SO
、CO
、NO
等形成化合物，则会使土壤板结。
有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。
5.酸碱指示剂是用来指示反应前后的酸碱性变化的。
尿素在被脲酶作用前是中性的，而作用后产生了NH3，变成了碱性，本实验使用酚红作为指示剂，在酸性情况下呈黄色，碱性情况下呈红色，变色范围是pH6.4～8.2。
培养后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，培养基中的尿素分解产生的氨使培养基变碱性，于是酚红由黄色变成红色，这就表明以尿素为氮源的细菌分泌了脲酶并分解了尿素。
圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。
1.在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。
利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出（ ）
A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌
C.固氮细菌、霉菌、放线菌
D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
答案 C
解析 固氮细菌可以在无氮培养基上生长；青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；加入10%的酚的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。
2.下列有关叙述，不正确的是（ ）
A.脲是一种有机化合物，含有氮元素
B.地表土壤中含有一定量的脲
C.以尿素为氮源的细菌含有脲酶
D.在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会导致培养基呈酸性
答案 D
解析 根据反应式：
（NH2）2C＝O＋H2O
2NH3＋CO2，在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会产生NH3，从而导致培养基呈碱性。
二、分离以尿素为氮源的微生物
1.实验中的对照设置
（1）实验组：
以尿素固体培养基进行培养。
（2）对照组：
以全营养LB固体培养基进行培养。
2.实验步骤
制备培养基：
将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基分别倒入两个培养皿中，摇匀，
平放至凝固
↓
制备细菌悬液：
用1g土样配制不同浓度的细菌悬液
↓
用涂布分离法分离细菌：
将不同浓度的土壤稀释液分别加入有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，并用玻璃刮刀涂布到整个平面上
↓
培养：
倒置培养皿，在37℃恒温箱中培养24～48h
↓
观察：
培养基中菌落数
阅读教材，回答问题：
1.实验原理
（1）以尿素为氮源的微生物含有脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。
（2）尿素固体培养基的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源生长繁殖，缺乏脲酶的微生物则由于不能分解尿素而不能生长繁殖，所以，用该培养基能够筛选分离出以尿素为氮源的微生物。
（3）脲酶可使尿素分解产生氨，从而可使加入酚红指示剂的尿素固体培养基变红。
2.实验步骤
（1）在60℃左右时，将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。
（2）制备细菌悬液（过程如图1）。
在无菌条件下，将1g土样加到有99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成10－2土壤稀释液。
依此法制备10－3、10－4和10－5土壤稀释液。
取样时，尽量只取悬液。
摇匀，放在试管架上。
（3）用涂布分离法分离细菌（如图2）。
取10－4和10－5的土壤稀释液各0.1mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
（4）将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24～48h。
观察菌落数。
3.观察结果（如图3）
全营养培养基中有较多的菌落，而尿素为氮源的培养基平板中只有少量菌落。
4.思考与讨论
（1）样品为什么要进行稀释？
有什么标准？
答案 样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。
稀释的标准：
选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300，便于计数。
（2）有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？
答案 细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素分解后产生氨，氨水为碱性，酚红在酸性环境中为黄色，在碱性环境中变为红色。
培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株能以尿素为氮源，红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。
红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。
（3）与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？
答案 这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有极少数。
因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，每人每天排泄约500～800mL尿，但随地便溺的不多，动物虽然随地便溺，但尿素还是可以在高温下自然分解的。
因此，以尿素为氮源的菌群较少。
（4）2013年11月22日凌晨3点，青岛黄岛区发生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制选择培养基将这类微生物选择出来？
答案 配制的选择培养基中，石油作为唯一的碳源，然后用这种培养基培养多种微生物，凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。
5.微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用
对照组
作用
现象
结论
未接种培养基
有无杂菌污染的判断
未接种的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
接种的牛肉膏蛋白胨培养基
选择培养基筛选作用的确认
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
3.现从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如下图所示：
→
→
→
→
请回答：
（1）欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，将土壤用进行一系列的梯度稀释，同一浓度的土壤稀释液应至少涂布个平板，通常以每个培养皿中有个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。
（2）接种后的培养皿于37℃的恒温箱中培养。
若培养基中存在含脲酶的细菌，其菌落周围会出现，这是由于尿素被分解产生氨气，与该培养基中的产生的颜色变化，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。
（3）分离能利用尿素的细菌时所用的培养基成分上最主要的特点是。
（4）下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的是（多选）（ ）
A.称取葡萄糖、琼脂糖等培养基成分
B.倒平板
C.涂布平板
D.微生物的培养
（5）与LB全营养培养基上的菌落数相比，尿素培养基上只有少数菌落的原因是
。
答案
（1）无菌水 3 20
（2）倒置 红色环带 酚红指示剂 （3）以尿素作为唯一氮源 （4）BC （5）土壤中能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量
解析
（1）涂布分离法必须先用无菌水对土样进行一系列的梯度稀释，通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。
（2）接种后需倒置培养皿恒温培养。
含有脲酶的细菌能够将尿素分解，产生的氨气使培养基呈碱性，导致培养基中的酚红指示剂呈红色。
（3）分离能利用尿素的细菌时所用的培养基应以尿素为唯一氮源。
（4）进行微生物培养和分离时，倒平板、涂布平板均需要在酒精灯火焰旁进行，以防杂菌污染。
（5）尿素培养基只以尿素为氮源，在尿素培养基上生长繁殖的只能是少数能够合成脲酶可利用尿素的细菌。
4.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是（ ）
A.将土壤用无菌水稀释，制备10－3～10－5土壤稀释液
B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上
C.用加入酚红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌
D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株
答案 C
解析 从土壤中分离以尿素为氮源的细菌时，将土壤用无菌水稀释，制备土壤稀释液；将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上；用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌；从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株。
一题多变
判断正误：
（1）（NH2）2C＝O＋H2O
2NH3＋CO2（ ）
（2）尿素固体培养基配制后需要在121℃（1kg/cm2压力）下灭菌15min（ ）
（3）本实验中的LB培养基和尿素培养基均为固体培养基（ ）
（4）接种后，应将培养皿正置，在37℃恒温箱中培养24～48h（ ）
（5）筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源（ ）
（6）分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低（ ）
答案
（1）√
（2）× （3）√ （4）× （5）√ （6）×
分离以尿素为氮源的微生物
1.给无氮培养基接种土壤稀泥浆的方法是（ ）
A.打开培养皿盖，取一根接种环蘸取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上
B.取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后蘸取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点
C.打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后蘸取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点
D.略微打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌，冷却后蘸取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点
答案 D
解析 接种过程中要防止外来杂菌的入侵，左手将培养皿打开一条缝隙，右手将接种环在火焰上灭菌，冷却后蘸取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点，否则用未冷却的接种环蘸取稀泥浆会杀灭菌种。
2.用来判断尿素固体选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是（ ）
A.未接种的尿素固体选择培养基
B.未接种的牛肉膏蛋白胨（全营养）培养基
C.接种了的牛肉膏蛋白胨（全营养）培养基
D.接种了的尿素固体选择培养基
答案 C
解析 将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于尿素固体选择培养基上的数目。
因此，选用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。
本实验的变量是培养基的种类，其他方面如接种，培养条件等应相同。
3.下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是（ ）
A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂糖、水
C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂糖、水
D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂糖、水
答案 A
4.请选出下列正确的操作顺序（ ）
①土壤取样 ②称取10g土壤，加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1mL土壤溶液进行平板涂布 ④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度
A.①→②→③→④B.①→③→②→④
C.①→②→④→③D.①→④→②→③
答案 C
5.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如图所示：
（1）图中物质A为，若要统计每克土壤样品中以尿素为氮源的细菌的活菌数目，宜采用法接种到尿素培养基上，对照组配制的培养基为培养基，若用同浓度的土壤稀释液接种，实验组培养皿中菌落数（填“大于”“等于”或“小于”）对照组。
在能利用尿素的细菌菌落周围，有红色环带出现的原因是
。
（2）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是灭菌。
A.高压蒸汽B.紫外灯照射
C.70%酒精浸泡D.过滤
（3）下列培养基中，能分离出分解尿素的细菌的是。
A.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水
B.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、尿素
C.NaCl、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物、尿素
D.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物
（4）欲将分离得到的以尿素为氮源的细菌进行扩大培养，应使用LB培养基。
答案
（1）无菌水 涂布（分离） LB全营养 小于 能利用尿素的细菌产生的脲酶，将培养基中的尿素分解，产生的氨使指示剂呈红色
（2）D （3）B （4）液体
课时作业
[基础过关]
1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是（ ）
A.筛选出能分解尿素的细菌
B.对分离的菌种作进一步鉴定
C.作细菌的营养成分
D.如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素
答案 B
解析 筛选出能分解尿素的细菌用选择培养基即可，不需要加指示剂。
加入指示剂的培养基，目的都是对要分离的菌种作进一步的鉴定。
2.土壤中分解尿素的微生物所需氮源为（ ）
A.硝酸B.氨
C.尿素D.蛋白胨
答案 C
解析 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源。
3.土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种（ ）
A.尿素酶B.脲酶
C.蛋白酶D.肽酶
答案 B
解析 能够分解利用尿素的细菌，其细胞内含有脲酶，可以把尿素分解成氨，然后进一步利用。
4.产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（ ）
A.一个细菌、液体培养基B.许多细菌、液体培养基
C.一个细菌、固体培养基D.许多细菌、固体培养基
答案 C
解析 在液体培养基中生活的细菌，无论是一个还是许多，肉眼都是看不见的。
在固体培养基上生活的细菌，当数目较少时也是看不见的。
当固体培养基上由许多细菌并且集中在较小范围内时，肉眼可见。
而菌落是一个细菌或几个细菌的子细胞群体，形成于固体培养基上，有一定的形态结构，所以肉眼可见。
同种细菌形成的菌落，形态结构是相同的。
如果是由许多细菌形成的菌落，就不可能有比较标准的形态，因为这许多细菌第一不可能是同一种细菌，第二不可能在培养基的同一个点上。
5.在培养基中加入尿素（唯一氮源），以分离出能分解尿素的细菌，这种加入尿素的培养基在功能上属于（ ）
A.选择培养基B.固体培养基
C.液体培养基D.半固体培养基
答案 A
解析 选择培养基是从功能上对培养基进行分类的，B、C、D三项所述的培养基是根据培养基的物理状态进行分类的。
题述培养基能分离出以尿素为唯一氮源的细菌，故是一种选择培养基。
6.下面对“从土壤中分离分解尿素的细菌过程中灭菌”的理解，不正确的是（ ）
A.防止杂菌污染
B.消灭全部微生物
C.稀释土壤溶液的过程必须在酒精灯火焰旁操作
D.灭菌必须在接种前进行
答案 B
7.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应10－6培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。
A同学的结果产生的原因不可能是（ ）
A.土样不同B.培养基污染
C.操作失误D.没有设置对照
答案 D
解析 实验结论是否正确与是否设置对照有直接关系，但实验结果与是否设置对照无关。
[能力提升]
8.下列有关尿素培养基的叙述，不正确的是（ ）
A.根据物理性质划分，该培养基属于固体培养基
B.培养基中的唯一氮源为尿素，用以筛选以尿素为氮源的微生物
C.培养基中的酚红，用以鉴别以尿素为氮源的微生物
D.培养基中加入G6玻璃漏斗过滤的尿素后，要用500g/cm2压力（90℃以上）灭菌30min
答案 D
解析 因为尿素加热会分解，所以应先将培养基经500g/cm2压力灭菌30min（为防止葡萄糖分解碳化），再添加G6玻璃漏斗过滤后的尿素。
9.测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍的稀释液，其原因是（ ）
A.细菌个体小，真菌个体大
B.细菌易稀释，真菌不易稀释
C.细菌在土壤中数量比真菌多
D.随机的，没有原因
答案 C
解析 土壤中的微生物大约70%～90%是细菌，真菌的数量要比细菌少。
样品的稀释度越高，在平板上生成的菌落数目就越少。
在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，适于平板计数，所以细菌的稀释倍数要高于真菌的稀释倍数。
10.如图是“分离以尿素为氮源的微生物”实验的基本流程，请回答下列问题：
（1）该实验培养基可以不含有。
A.尿素B.氯化钠
C.葡萄糖D.琼脂
（2）尿素溶液可用使之无菌。
若要检查B过程灭菌是否彻底，可以采用的方法是。
（3）图中步骤C为。
相对于划线分离法，过程D涂布分离法的优点是。
（4）如果菌落周围出现色环带，说明该菌落能分泌脲酶。
答案
（1）B
（2）G6玻璃漏斗过滤 将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间，观察有无菌落出现
（3）倒平板 单菌落更易分开
（4）红
解析
（1）分解尿素的细菌是异养微生物，因此培养基中应该加入有机碳源，如葡萄糖；分离分解尿素的细菌的培养基从功能上分属于选择培养基，应该以尿素为唯一氮源；从物理性质上分属于固体培养基，因此应加入凝固剂琼脂。
故选B。
（2）尿素溶液可用G6玻璃漏斗过滤使之无菌。
若要检查B过程灭菌是否彻底，可以采用的方法是将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间，观察有无菌落出现。
（3）图中步骤C为倒平板。
相对于划线分离法，过程D涂布分离法的优点是单菌落更易分开。
（4）如果菌落周围出现红色环带，说明该菌落能分泌脲酶。
11.芽孢杆菌是一种耐高温的细菌，可用于植物保护、饲料添加及环境净化。
为获取土壤中的芽孢杆菌，某同学进行了相关实验，操作流程如下图：
（1）上图中85℃处理10分钟的目的是。
上图中步骤A为，步骤B为。
要判断培养基灭菌是否彻底，可采用的方法是。
（2）下列消毒灭菌方法中，常用于接种环灭菌的是。
A.70%酒精浸泡B.紫外线照射
C.灼烧D.高压蒸汽
（3）请分析划线分离法能得到单菌落的原因：
。
若要对每克土样中所含芽孢杆菌进行计数，应采用接种方法。
（4）菌株经鉴定后，可进一步接种到培养基中扩大培养，培养时需要。
答案
（1）筛选出耐高温菌株 倒平板 培养 将灭菌后的培养基培养一段时间后观察是否出现菌落
（2）C（3）划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，到划线最后部分细菌间距离加大，经培养后能得到单菌落 涂布分离
（4）LB液体 振荡
12.幽门螺杆菌（Hp）感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。
在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。
实验基本步骤如下：
→
→
→
→
请回答：
（1）在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现色环带。
（2）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是。
A.高压蒸汽B.紫外灯照射
C.70%酒精浸泡D.过滤
（3）步骤X表示。
在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液到培养基平面上。
菌液稀释的目的是为了获得菌落。
（4）在培养时，需将培养皿倒置并放在中。
若不倒置培养，将导致。
（5）临床上用呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将标记的分解为氨和二氧化碳。
答案
（1）脲酶 红
（2）D （3）接种 涂布 单一 （4）恒温培养箱 无法形成单一菌落 （5）尿素
解析 能以尿素作为氮源的微生物体内含有脲酶，可将尿素分解为CO2和NH3，NH3遇酚红指示剂会显红色。
尿素不能高温灭菌，因为加热会导致尿素分解，所以应该用过滤方法灭菌。
将稀释菌液接种到培养基上的方法应该是涂布分离法。
培养时，培养皿应倒置，否则水蒸气遇培养皿盖冷凝形成水珠滴落到培养基上，会使菌落相互粘连，导致无法形成单菌落。
[个性拓展]
13.下面是探究如何从土壤中分离出自生固氮菌及其计数的实验，完成下列问题：
实验原理：
农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。
将用表层土壤制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。
在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。
用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离。
材料用具：
农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛有9mL无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛有90mL无菌水的锥形瓶、恒温箱。
（1）方法步骤：
①倒平板：
分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在操作。
②制备土壤稀释液：
取土样10g加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。
用无菌吸管吸取上清液1mL，转至盛有9mL无菌水的试管中，依次稀释到10－7稀释度。
③涂布：
按照由10－7～10－3稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布个平
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