实用血培养厌氧菌分离鉴定及药敏试验方.doc

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实用厌氧菌分离鉴定及药敏试验方法

临床重要的厌氧菌（主要是内源性）主要是拟杆菌科（G-b）和厌氧球菌。

血培养阳性厌氧菌主要有拟杆菌属、梭杆菌属、、普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、消化链球菌属及其他厌氧菌。

一、必需的设备

•厌氧罐、厌氧盒、厌氧袋（标本少）

•厌氧发生气袋

•厌氧指示剂

二、培养基的准备

•非选择厌氧血平板

布氏血平板

脑心浸液琼脂

CDC厌氧血琼脂

哥伦比亚血琼脂

新鲜配制或经24h预还原（厌氧环境放置）！

！

！

特殊成份（降低氧还电势）:

L-半胱氨酸、氯化血红素（Hemin）、VitK1

·选择性厌氧血平板：

自制、商商品化

三、厌氧血培养瓶报警后

步骤一：

转种

转种（四区划线）

需氧

厌氧

血平板、巧克力平板，5％CO2

还原后的厌氧血平板

24h检查

生长，G染色，分离，鉴定

——

48h检查

原始平板是否有新菌落出现

打开

步骤二：

耐氧试验确认厌氧菌

培养48h后可能有以下几种情况

需氧

厌氧

血平板

巧克力平板

处理方法

厌氧血平板

处理方法

情况一

+

+

常规

+

耐氧试验、G染色

再培养48h

情况二

—

+

可能流感杆菌

+

情况三

—

—

+

G染色，厌氧菌

情况一和二：

耐氧试验24-48h再观察结果，有确认厌氧菌的菌落按下边鉴定步骤。

耐氧试验方法：

选择每种形态的单菌落，转种一个厌氧血平皿和巧克力平皿，分别培养。

情况三：

相当于耐氧试验，再结合菌落菌体形态，可以确认厌氧菌，用以下方法鉴定。

四、厌氧菌鉴定方法

（一）快速商品鉴定系统（4h报告结果）

1无须厌氧培养，4h培养后人工输入结果，电脑软件辅助报告结果：

VITEKANI卡

RapID32A

MicroScanAnareobePanel

RapIDANAII等

2厌氧环境培养24-48h观察结果

API20A

特点是快速，可鉴定到种水平，但有时不一定获得满意结果，可同时进行以下操作提供临床初步报告。

（二）初步鉴定方法

1临床重要的厌氧菌特殊菌落形态和菌体形态及特征（图示）

·G-cb有色素——普雷沃菌、卟啉单胞菌

·细G-b，两端变尖——具核梭菌

·多晶（空泡），染色着色浅G-b——拟杆菌属

·非常小的G-c——韦容球菌属

·“咬”琼脂（凹陷）——解尿拟杆菌群

2产色素、荧光

·产黑色素拟杆菌——卟啉单胞菌、普雷沃菌

·砖红色荧光——中间普雷沃菌、洛氏普雷沃菌

·黄绿色荧光——梭杆菌属

3特殊鉴定用抗生素纸片（Oxoid,BBL,Diffico等）

万古霉素5μg/ml

卡那霉素1,00μg/ml

多粘菌素10μg/ml

聚茴香脑磺酸钠（SPS）1,00μg/ml：

抑菌环直径小于10mm（R），大于12mm（S）

于厌氧血平皿贴1/4平皿（划线第一区）；如果需要硝酸盐或SPS纸片，则贴另1/4区

菌群万古卡那多粘菌素SPS

G-RVV

G+SVV

B.frag群RRR

解尿拟杆菌群RSS

梭杆菌属RSS

卟啉单胞菌属SRR

普雷沃菌属RRV

韦荣氏球菌属RSS

厌氧消化链球菌SRsRS

其他G+cSSRR

4生化反应

触酶、吲哚、硝酸盐

五、厌氧菌药敏

1经验用药

J>99%厌氧菌对甲硝唑、克林霉素、氯霉素、亚胺培南敏感

J95—99%β-内酰胺酶/β-内酰胺酶抑制剂复合抗生素类、

K革兰阴性厌氧杆菌对头孢菌素类抗生素敏感性不同，头孢菌素类、β-内酰胺酶、青霉素类等。

2常规做厌氧菌药敏试验指征

·脑脓肿、心内膜炎、骨髓炎、关节感染、血管移植、辅助装置、菌血症从正常无菌部位来源的标本，除非确认是污染的。

J医生是否要求做药敏试验是非常重要的

L当几种菌混合感染确定哪个菌做药敏，做什么抗生素很难判断，一般来讲，具有高致病性的菌或不能预测药敏结果的常用抗生素，或两者具备，考虑做药敏试验，包括拟杆菌属某些种，普雷沃菌属、梭杆菌属，梭菌，Bilophila,andSutterella.

L不能用临床标本直接做药敏

3常规厌氧菌药敏方法

1）β-内酰胺酶

除脆弱拟杆菌外的菌在做药敏试验前都应检测β－内酰胺酶试验。

决大多数脆弱拟杆菌都产β－内酰胺酶，应报告青霉素、阿莫西林和氨苄西林耐药。

2）E-test方法

重症，血培养来源的厌氧菌适用。

E-test方法是琼脂稀释法的替代方法，注意判读结果时尽量保守，否则容易出现“非常主要错误”。

E-test方法是精确和实用的药敏试验方法。

3）其他适合临床使用的商品药敏系统

Dubreuil等评价ATBANA（Version96）系统（生物梅里埃）与琼脂稀释法对200株临床分离厌氧菌对9种抗生素的结果后指出，ATBANA是临床做厌氧菌药敏试验非常方便的方法，结果与参考方法较符合。

此系统可按照法国临床微生物学会抗生素分会和NCCLS两种标准解释结果。

六、报告结果

初级报告

最终报告