动物遗传育种实验技术指导教材.docx

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动物遗传育种实验技术指导教材

动物遗传育种实验技术

实验一预备实验

实验二基因组DNA提取

实验三核酸纯度、浓度与分子量测定

实验四PCR及RT-PCR

实验五DNA片段的回收和纯化

实验六DNA片段与载体的连接及转化

实验七质粒DNA提取

实验一预备实验

1.主要仪器设备

1.1高速冷冻离心机

1.2PCR扩增仪

1.3DNA/RNA浓度测定仪

1.4电泳系统

1.5计算机成像系统

1.6多功能恒温箱

1.7超净工作台、摇床、紫外透射仪等

2.工具酶及试剂盒

2.1限制性内切酶

2.2PCR扩增试剂盒

2.3DNA片段回收纯化试剂盒

2.4质粒提取及纯化试剂盒

3.主要药品及试剂

3.1琼脂糖、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS）、SET

3.2三羟甲基氨基甲烷（Tris）

3.5LB培养基、氨苄等

3.6DL2000Marker、6×loadingbuffer

4.主要试剂和溶液的配制

4.11MTris·Cl（1L：

800mlH2O中加121.1gTris,用浓HCl调pH至8.5后定溶至1升，灭菌）

4.20.5MEDTApH8.0（1L:

800mlH2O中加186.1g二水（EDTANa2·2H2O），用NaOH调pH至8.0，定溶至1升）

实验二基因组DNA提取

一、目的

掌握提取DNA原理及方法

二、概述

DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。

DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。

在酸性溶液中，DNA天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。

要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。

DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。

DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。

RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。

因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。

苯酚/氯仿作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。

此法的特点是使提取的DNA保持天然状态，真核细胞DNA的分离通常是在EDTA及SDS一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞获得。

三、主要试剂

1、EDTA、SDS、SET、蛋白酶K

2、Tris饱和酚、氯仿异戊醇（23：

1）、无水乙醇、75%乙醇

四、操作步骤

1.30-40ul血液+470ulSET+12.5ul20%SDS+6ul蛋白酶K→摇匀，55℃水浴过夜（按顺序加）；

2.加苯酚500ul,10min摇匀,离心10000r/min10min；

3.抽上清，加500ul氯仿异戊醇（23：

1）,20min摇匀,离心10000r/min10min；

4.抽上清,加无水乙醇（冰冻）1000ul,摇匀，冷冻于-20℃（20分钟以上），离心10000r/min2min；

5.弃上清，加75%乙醇1000ul，离心10000r/min2min；

6.弃上清，55℃烘干，加TE（或ddH2O）300ul溶解DNA沉淀，4℃保存或电泳。

附:

提DNA所用试剂配方：

1.20%SDS  （2L:

在2L热水中缓慢加400gSDS，边加边搅拌，溶解后放置热地方保存）

2.5MNaCl（1L:

750mlH2O中加292.2gNaCl，溶解后定溶至1升，灭菌）

3.100xTE（1L:

800mlH2O中加121.1gTris,37.2EDTANa22H2O,用HCl调pH至8.0,定溶，灭菌）

4.50×TAE（1L:

500mlH2O中加242gTris，溶解后加100ml0.5MEDTApH8.0和57.1ml冰醋酸，定溶）

五、注意事项

不同要求时可选择不同抽提方法提取DNA；注意实验安全

实验三核酸纯度、浓度与分子量测定

一、目的

了解测定核酸浓度、纯度的原理和操作方法。

二、概述

凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性条件下带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。

不同的DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。

线性DNA样品在凝胶中的迁移率与DNA的对数值成反比，可在电泳中加入核酸分子量标准来确定电泳后核酸的分子量。

溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）是一种荧光染料，在凝胶电泳中，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下发出荧光,其强度与DNA量成正比。

同时核酸最大吸收波长在260nm，在此波长下，吸光度1A相当于一定浓度的核酸，可以通过A260/A280的比值，来测定所得核酸的纯度。

三、材料

电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，点样板，微波炉，琼脂糖，TBE电泳缓冲液，TEbuffer，溴化乙锭（EB），载样缓冲液，紫外分光光度仪，凝胶图象分析仪等

四、操作步骤

（一）紫外分光光度（Spectrophotometer）法：

1.将分光光度计打开，预热10分钟。

2.将核酸溶液中取2µl，加（或纯水）使体积成为100µl。

3.将稀释溶液加入石英管，以TEbuffer（或纯水）为标准倒入另一管。

4.在波长260、280nm处测定吸光值。

5.比较在260nm及280nm之读值。

（二）Ethidiumbromide染色法：

利用一系列不同浓度的DNA标准溶液（0、2.5、5、10、20、30、40、50ng/l），或已知浓度的DNAmarker，和未知浓度DNA样品一起进行琼脂糖凝胶电泳，以EB染色后，在凝胶图象分析仪上观察，比较标准浓度及未知浓度的亮度，来求取DNA的含量；比较DNA样品与DNAmarker条带位置，推知DNA样品分子量。

实验步骤主要包括制胶、点样以及电泳等过程。

1.称取1.5g琼脂糖加入盛有100ml0.5×TBE电泳缓冲液三角瓶中，摇匀，在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。

加入溴化乙锭（EB）至终浓度0.5ug/ml，并摇匀。

2.用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固。

3.充分凝固后撕掉两端的胶布，垂直向上小心拔出梳子，以保证点样孔完好。

凝胶置入电泳槽中，加0.5×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。

4.用移液器吸取DNA样品8μl与2μl的载样缓冲液混匀，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。

同时点10μlDNAMarker作为分子量标准。

5.打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到条带由负极向正极移动，约半小时后即可观察。

6.在凝胶图象分析仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小；同时比较标准浓度及未知浓度的亮度，求取DNA的含量。

五、注意事项

1、A260/A280>1.8表示DNA/RNA的纯度高。

若数值<1.8，表示纯度低，这时由OD260测得的DNA含量较不可信，核酸溶液中含有较多蛋白质，因此最好将前述所得核酸再重新抽取。

2.测定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：

1）dsDNA（doublestrandedDNA）=50g/ml

2）ssDNA（singlestrandedDNAorsimgle-strandedRNA）=40g/ml

3）oligonucleotide=33g/ml

3.EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。

实验四PCR及RT-PCR

一、目的

掌握聚合酶链式反应（PCR）及逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）的基本方法

二、原理

PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。

在由TaqDNA聚合酶催化的一系列合成反应中，使用两段寡核苷酸作为反应的引物。

一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增的两侧。

反应时它包括三个基本步骤:

（1）变性（Denature）:

目的双链DNA片段在94℃下解链;

（2）退火（Anneal）:

两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对;（3）延伸（Extension）:

在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。

RNA的多聚酶链式反应（RT-PCR）是以RNA为模板，联合逆转录反应（reversetranscrip－tion,RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。

RNA扩增包括两个步骤：

①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；②加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。

在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录，cDNA的PCR与一般PCR条件一样。

由于引物的高度选择性，细胞总RNA无需进行分级分离，即可直接用于RNA的PCR。

但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格，作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。

RNA中即使含有极微量的DNA，经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白质未除净，与RNA结合后会影响逆转录和PCR；残存的RNase极易将膜板RNA降解掉。

硫氰酸胍（GaSCN）-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品，尤以后者方法为佳，适合一般实验室进行。

常用的逆转录酶有两种，即禽类成髓细胞性白血病病毒（Avianmyeloblastosisvirus,AMV）和莫洛尼鼠类白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus,MO-MLV）的逆转录酶（RT）。

一般情况下用Mo-MLV-RT较多，但模板RNA的二级结构严重影响逆转录时，可改用AMV-RT，因后者最适温度为72℃，高于Mo-MLV-RT的最适温度（37℃），而较高的反应温度有助于消除RNA的二级结构。

　一步法扩增（onestepamplification）是为了检测低丰度mRNA的表达，利用同一种缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。

发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后的PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化，所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。

用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。

该法还可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cD－NA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在一个试管中进行。

三、材料

（一）仪器

1.PCR仪

2.台式高速离心机

3.电泳仪、电泳槽

4.凝胶成像仪

（二）塑料器皿

吸头、96孔板、PCR管、离心管

（三）其他物品

微量加样枪（2.5μl、10μl和100μl各1支）

（四）试剂

1.10×PCR缓冲液（不含MgCl2）

2.5mmol/LdNTPs,4种dNTP每种浓度均为2.5mmol/L

3.TaqDNA聚合酶（5u/ul）

4.MgCl2，25mmol/L

5.5×TBE电泳缓冲液

6.10g/L溴化乙锭

7.1%〜2%琼脂糖凝胶（浓度视待扩增的DNA片段大小而定）

8.两对套叠式引物

四、操作步骤

（一）以DNA为模板的PCR扩增反应

1.按以下次序，将各成分在0.2mlEppendorf管中混合：

1）模板DNA（100mg/L）1ul

2）2×EcoTaqPCRSuperMix5ul

3）ForwardPrimer0.1ul

4）ReversePrimer0.1ul

5）ddH2Oupto10ul

2.将溶液混匀

3.按以下方法进行扩增。

194℃3min

94℃30s

50～60℃30s

72℃1kb/min

（30～35cycles）

272℃5-10min

316℃forever

4.将扩增产物DNA进行凝胶电泳

（二）以mRNA为模板的PCR扩增反应

1.设置合成cDNA第一链的反应：

1）4×扩增缓冲液2.0ul

2）2.5mmol/LdNTP2.0ul

3）Oligo（dT）12-18（100mg/L）0.5ul

4）RNAinhibitor20U

5）mRNA1ul

6）25mmol/LMgCl22ul

7）加水至终体积20ul

*可用10-50pmol随机引物代替Oligo（dT）作为引物。

2.将溶液混匀，以15000r/min离心10秒钟，将反应混合液置65℃变性5min，使mRNA均变为单链。

3.将100-200单位MMLV反转录酶加入混合物中，混匀，将反应混合物置37℃温育30min。

4.将温育后产物cDNA取出一部分按照以DNA为模板的PCR扩增反应步骤进行预定循环数的扩增反应。

五、注意事项

1.PCR引物摩尔数的计算在PCR反应中，引物的量是以pmol数表示的，而合成引物后，引物的量是以OD值表示的。

因此，需经适当换算，才能配置适当浓度的引物溶液。

换算公式如下：

1）OD值为1的引物约为33ug。

2）引物的分子量=碱基数×330

3）引物pmol数=OD值×33×1000000=OD值×100000

4）碱基数×330碱基数×330

2.结果假阴性：

出现假阴性结果最常见的原因是：

TaqDNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。

所以在实验中出现假阴性失败时，首先在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶、增加5-10次循环，一般都会获得成功。

如果没有成功应检查PCR扩增仪的温度是否准确，采集标本是否有问题。

为了防止假阴性的出现在选用TaqDNA聚合酶时，要注意用活力高质量好的酶。

同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。

尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。

PCR扩增的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补，尤其是要绝对保证引物的3′端与靶基因的互补。

对变异较大的扩增对象，宜采用巢式（Nested）PCR或doublePCR。

在进行PCR操作时应注意Mg2+的浓度要合理。

PCR反应的各温度点的设置要合理。

3.结果假阳性：

PCR结果的假阳性是对被检测标本而言，而反应系统中所扩增的产物是真实的。

因为PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增，而造成结果判断上的失误，所以污染是PCR假阳性的主要根源。

PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。

出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。

为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次性吸头。

实验五DNA片段的回收和纯化

一、目的

掌握从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段的原理及方法

二、原理

在高离子盐存在的情况下，DNA片段选择性地吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗—离心的步骤去蛋白液和漂洗液将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。

三、试剂及材料

北京百泰克快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒II（离心柱型）

四、操作步骤

第一次使用前先在漂洗液WB中加入瓶子标签指定量无水乙醇。

1.配制琼脂糖凝胶,电泳以分离DNA片段。

2.电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来，并尽量去除多余的凝胶。

注意：

DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒

3.切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量，近似地确定其体积。

加入等倍凝胶体积的溶胶/结合液DB，把混合物置于56℃水浴中温浴3-5min至凝胶完全融化，其间每隔1-2分钟混匀一次。

4.将上一步所得溶液加入微量吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。

如果总体积超过900μl，可分两次将溶液加入同一微量吸附柱中。

5.加入900μl漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃掉废液。

6.将微量吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

7.取出微量吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加15-30μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热），室温放置2min，12,000rpm离心1min。

如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于10μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少产量。

实验六DNA片段与载体的连接及转化

一、目的

掌握外源DNA片段和质粒载体的连接反应的方法。

二、概述

质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。

如果要克隆较小的DNA片段（＜10kb＝且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。

在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段,然后体外使两者相连接,再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。

但在实际工作中,如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。

通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。

三、材料及试剂

（一）材料

1.外源DNA片段

2.载体DNA:

pGEM-TEasyVector

3.宿主菌:

E.coliDH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。

（二）设备

1.恒温摇床

2.台式高速离心机

3.恒温水浴锅

4.琼脂糖凝胶电泳装置

5.电热恒温培养箱

6.电泳仪无菌

7.工作台

8.微量移液枪

9.eppendorf管

（三）试剂

1.LB固体和液体培养基

2.T4DNA连接酶（T4DNAligase）；购买成品。

3.含AmpLB固体培养基:

将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

四、操作步骤

（一）连接反应

2×RapidLigationBuffer，T4DNAligase5μl

pGEM-TEasyVector1μl

PCRproduct3μl

T4DNAligase1μl

4℃连接过夜。

（二）转化

1.加5μl连接产物于30μl感受态细胞中（冰浴融化），轻弹混匀，冰浴30min（冰上操作）

2.42℃热激30s，立即置于冰上2min

3.加至700μl平衡至室温的LB液体培养基，37℃摇床200rpm，培养1h

4.铺板:

取100μl菌液铺板至LA固体培养基，37℃培养过夜。

（三）重组质粒的筛选

1.每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。

2.倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。

3.不带有pGEM-T质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。

（四）PCR菌液鉴定重组质粒

4.挑取白色单菌落接种于含Amp50μg/ml的700μlLA液体培养基中,37℃下振荡培养3小时。

5.取1μl菌液作为模板进行PCR扩增，并电泳检测。

五、注意事项

1.连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。

2.粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。

3.在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。

实验七质粒DNA提取

一、目的

掌握质粒DNA提取的原理及方法

二、概述

质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。

这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。

质粒DNA小量提取试剂盒的原理是：

采用改进SDSS碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐。

低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

三、试剂及材料

北京百泰克高纯质粒小量制备试剂盒、RNaseA

四、操作步骤

第一次使用前先在15ml漂洗液WB中加入45ml无水乙醇。

将RNAaseA全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。

1.取1.5-4.5ml过夜培养的菌液，9，000rpm离心30s，弃上清，收集菌体，尽可能倒干上清。

处理超过1.5ml菌液可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直至收集到足够的菌体。

2.用250μl溶液P1中重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。

如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3.加250μl的溶液P2，温和地上下翻转6-10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。

温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！

所用时不应