迪安分子诊断教材.docx

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迪安分子诊断教材

  “全世界每年死亡的患者中，有1/3是药物不良反应所致。

这是由传统的给药方式造成的，医生没有考虑人的个体差异，而是千人一药，千人一量。

”——中国遗传药理学的开拓者、中国工程院院士周宏灏

        大规模人群调查和世界卫生组织调查均发现药物安全性问题是住院病人致死最重要的原因之一，居于全部死亡原因的第五位。

最佳用药剂量很大程度上取决于药物相关基因变异，即单核苷酸多态性（SNP）。

SNP的复杂性决定了药物反应的多态性，所以个体化用药也意味着理想的治疗需要进行全基因组的药物筛选。

目前，个体化治疗已经成为恶性肿瘤、高血压、糖尿病等重大慢性疾病临床治疗的发展方向和最有效的手段。

肿瘤个体化用药及有关检测    

        目前常用的抗肿瘤化疗药物对患者治疗的有效性低于70%，约20%-35%的患者接受了不恰当的药物治疗。

如果肿瘤治疗能够同病异治、因人而异、实施个体化治疗，将能够大大提高疗效，避免过度治疗和降低患者经济负担，减少医疗资源的浪费。

随着药物基因组学以及蛋白质组学、转录组学等高通量分子检测技术的出现，分子靶向技术治疗癌症的个体化治疗手段——即从个体基因组中分析和鉴别患者之间存在的疾病相关的个体差异，并利用这些差异来合理的指导临床治疗，已经成为医学界广泛共识。

        卫生部2010年11月首次发布了《结直肠癌诊疗规范》，明确规定：

确诊为复发或转移性结直肠癌时，应进行相关基因状态检测，制定个体化治疗方案，患者确定为复发或转移性结直肠癌接受爱必妥、帕尼单抗（抗EGFR单抗）时，必须检测肿瘤组织的KRAS基因状态。

肿瘤细胞表面存在着接收不同信号的通道。

抗EGFR单抗通过阻断EGFR二聚体的形成，抑制其下游的细胞内信号传导，从而抑制肿瘤细胞的存活、增值等。

但如果KRAS基因突变可旁路激活细胞内信号传导，从而导致抗EGFR单抗失效。

所以，通过检测KRAS基因有否突变，医生就可以有针对性地区别给药。

南京军总全军病例中心——迪安分子病理诊断中心

        南京军区南京总医院病理科是国内规模最大、水平最高的病理专业科室之一，同时开展医教研全面工作的病理专业科室，2005年首批成为全军临床病理中心。

迪安诊断与南京军总病理中心整合优质技术资源，建立了“南京军总全军病理中心-迪安分子病理诊断中心”，配备了领先的技术平台（包括基因芯片、基因测序、实时荧光PCR、荧光原位杂交技术等），由多位博士、教授、主任医师亲自指导，旨在为华东乃至全国的医疗机构和患者提供高质量的肿瘤分子检测、诊断、咨询及学术推广服务。

中心是全国性的、少有的具有医疗资质的专业分子病理诊断平台，是您肿瘤个体化用药相关检测服务的最佳选择。

技术平台

一：

焦磷酸测序平台

      QIAGEN公司基于Pyrosequencing技术而研究开发的PSQ96系统是一个理想的遗传分析技术平台，它既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的SNP检测及等位基因频率测定,它具有以下优点：

1．不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素。

2．10分钟内可分析96个样品的SNP，可满足高通量分析的要求。

3．每个样品孔都可进行独立的测序或SNP分析，实验设计灵活。

4．序列分析简单，结果准确可靠。

利用该技术平台可开展以下项目：

1．临床药物基因组学

2．微生物分型及耐药检测

3．疾病风险预测

4．临床遗传学 

5．DNA甲基化程度定量分析

6．法医学鉴定

       焦磷酸测序法应用于肿瘤基因突变及甲基化、个性化用药相关检测相比荧光定量PCR法和Sanger测序法检测，具有更高的灵敏度，准确性和更高的通量，结果直观，判读更加简单、准确、快速，具有明显的优势。

二、荧光定量PCR（RocheLlightCyclerTM480）结合高分辨融解曲线平台

      高分辨率熔点曲线分析（HighResolutionMeltingAnalysis，HRM），无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，应用RocheLlightCyclerTM480荧光定量PCR仪器分析，即可完成对样品基因型的判断：

◆操作简便快捷——通过实时荧光PCR+HRM技术，90分钟即可获得多达数十个样本的检测结果。

◆灵敏度高——最低检测限为5-10个基因拷贝。

◆选择性好——可在混有野生型基因组DNA情况下，检测出0.1-0.01％的突变基因，是测序方法的25倍-250倍。

   可检测血清、血浆、尿沉渣等样本的微量突变或异常甲基化基因，可动态监测肿瘤靶向药物治疗后的突变情况。

三、荧光原位杂交（FISH）平台

      FISH（fluorescenceinsituhybridization）技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。

它的基本原理是:

如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。

将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

       FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:

1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。

在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。

     不同的血液肿瘤往往有其特异的染色体异常（异位、错配等），利用FISH技术检测血液肿瘤的细胞遗传学改变，为血液肿瘤的诊断，预后评估，治疗监测等提供了重要依据。

     肿瘤个性化用药方面，运用FISH技术检测肿瘤基因基因拷贝数检测，相比免疫组化和定量PCR更加准确、灵敏、客观，可指导临床肿瘤靶向药物的治疗。

基因单项解释

EGFR基因外显子18,19,21,20/T790M突变检测

      以表皮生长因子受体（EGFR）作为靶点的靶向药物是靶向治疗中的重要一部分。

目前FDA已经批准的作用于EGFR的靶向药物包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI），包括吉非替尼（易瑞沙，阿斯利康制造）和厄洛替尼（特罗凯，罗氏制造）。

临床应用表明，EGFR-TKI仅对部分病人有效，进一步研究发现，EGFR基因外显子18,19,21突变是EGFR-TKI靶向药物起作用的前提条件；而外显子20/T790M突变是造成继发耐药的主要原因。

因此，专家推荐在使用EGFR-TKI靶向药物之前进行EGFR基因外显子18，19，21，20/T790M突变检测有助于提高用药的针对性，避免不必要的损失。

 EGFR靶向药物疗效

 EGFR基因外显子18，19,21，20/T790M突变

 EGFR-TKI可专一性的抑制EGFR而减缓肿瘤细胞的生长，但不会降低用药者血液中的白血球、血小板，也不会导致患者出现呕吐、掉发等常见于化疗中的副作用。

研究表明，肺癌组织中EGFR酪氨酸激酶基因编码区外显子18,19或21突变的患者，使用EGFR-TKI治疗的有效率可达80%以上；

外显子20/T790M突变率在肺癌病人中占50%。

临床实践表明，EGFR-TKI仅对10-30%的非小细胞肺癌（NSCLC）患者有显著疗效。

进一步的研究发现,EGFR基因酪氨酸激酶区突变是EGFR-TKI起作用的必要前提条件；

而有部分病人在使用靶向药物治疗一段时间后会出现继发耐药。

临床实践表明，EGFR外显子18,19,21突变的分布与EGFR-TKI治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的优势人群相一致，主要见于女性、非吸烟者、肺腺癌及亚裔患者；

外显子20/T790M突变不仅对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药，而且T790M突变还导致肿瘤细胞生长加速。

ERCC1基因表达检测

      在化疗药物中，顺铂（CDDP）、卡铂（CBP）和奥沙利铂（L-OHP、草酸铂、乐沙定）等铂类药物是目前临床上最常用的肿瘤化疗物之一。

这类药物的耐药有多个因素参与，其中DNA修复（特别是核苷酸切除修复，NER）能力加强，是铂类化疗耐药性产生的主要机制之一。

 铂类化疗药物

 ERCC1基因表达

 铂类药物的药理作用主要是引起靶细胞DNA链内和链间的交联，阻碍DNA合成与复制，从而抑制肿瘤细胞的生长。

ERCC1（excisionrepaircrosscomplementgroup1）是核酸外切修复家族中重要成员，为NER系统关键成员，参与DNA链的切割和损伤识别。

ERCC1的表达直接影响DNA的修复过程。

铂类药物广泛用于各种肿瘤的临床治疗，包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈部癌等。

所有肿瘤细胞均有ERCC1基因的表达，但表达差异很大。

临床研究表明，ERCC1表达水平低的患者对铂类药物敏感，反之耐药。

铂类药物虽是化疗的经典药物，但许多患者采用铂类药物治疗后疗效差异很大且出现不同程度的毒副作用。

采用个体化检测对患者“分门别类”的治疗有助于提高用药的准确性和针对性。

用药相关检测项目表

结直肠癌

药物

检测基因（具体检测项目见后面目录）

靶向药物

西妥昔单抗（爱必妥）、帕尼单抗（维克替比）

（血）K-ras突变、（血）B-raf突变、EGFR拷贝数、PIK3CA突变、PTENmRNA、VEGFR2mRNA

化疗药物

5-FU、卡培他滨

MTHFRSNP-C677T、DPDSNP-IVS14+1G>A、TSmRNA

卡铂、顺铂、奥沙利铂

ERCC1mRNA、BRCA1mRNA、ERCC1SNP、XRCC1SNP、GSTM1SNP、GSTP1SNP-I105V

伊立替康

UGT1A1SNP

胃癌

药物

检测基因（具体检测项目见后面目录）

靶向药物

曲妥珠单抗（赫赛汀）

HER2拷贝数、PIK3CA突变

厄洛替尼（特罗凯）、吉非替尼（易瑞沙）

（血）EGFR突变、（血）K-ras突变、EGFR拷贝数

拉帕替尼（泰克泊）、索拉菲尼（多吉美）

PDGFRαmRNA、VEGFR2mRNA、VEGFmRNA

化疗药物

5-FU、卡培他滨

MTHFRSNP、DPDSNP、TSmRNA

表阿霉素、阿霉素

GSTP1SNP、MDR1SNP

卡铂、顺铂、奥沙利铂

ERCC1mRNA、BRCA1 mRNA、ERCC1SNP、XRCC1SNP、

GSTM1SNP、GSTP1SNP

伊立替康

UGT1A1SNP

吉西他滨（泽菲）

RRM1mRNA

紫杉醇、多西紫杉醇

TUBB3mRNA、STMN1mRNA、GSTP1SNP

培美曲塞

TSmRNA、TYMSSNP

依托泊苷

UGT1A1SNP、MGMT甲基化

胃肠道间质瘤

药物

检测基因（具体检测项目见后面目录）

靶向药物

伊马替尼（格列卫）、舒尼替尼（索坦）

C-Kit突变、PDGFRα突变

肝癌

药物

检测基因（具体检测项目见后面目录）

靶向

药物

索拉菲尼（多吉美）、舒尼替尼（索坦）

PDGFRαmRNA、VEGFRmRNA、VEGFmRNA

贝伐单抗（安维汀）

VEGFRmRNA、VEGFmRNA

化疗

药物

卡铂、顺铂、奥沙利铂

ERCC1SNP、ERCC1mRNA、BRCA1mRNA、XRCC1SNP、GSTP1SNP、GSTM1SNP

5-FU、卡培他滨

MTHFRSNP、DPDSNP、TSmRNA

阿霉素

GSTP1SNP、MDR1SNP

吉西他滨（泽菲）

RRM1mRNA

丝裂霉素

NQO1SNP

依托泊苷、伊立替康

UGT1A1SNP、MGMT甲基化

乳腺癌

药物

检测基因（具体检测项目见后面目录）

靶向药物

曲妥珠单抗、拉帕替尼

HER2拷贝数、PIK3CA突变

激素类

药物

来曲唑（芙瑞）、阿那曲唑（艾达）

CYP19A1SNP、CYP19A1SNP、HER-2mRNA

他莫昔芬

CYP2D6SNP

化疗药物

阿霉素

GSTP1SNP、MDR1SNP

卡铂、顺铂、奥沙利铂

ERCC1mRNA、BRCA1 mRNA、ERCC1SNP、XRCC1SNP、GSTM1SNP、GSTP1SNP

紫杉醇、多西紫杉醇

TUBB3mRNA、STMN1mRNA、GSTP1SNP

吉西他滨（泽菲）

RRM1mRNA

5-FU、卡培他滨

MTHFRSNP、DPDSNP、TSmRNA

环磷酰胺

CYP2C9SNP

甲氨蝶呤

MTHFR

检测套餐

乳腺癌21基因+复发风险评估

卵巢癌

药物

检测基因（具体检测项目见后面目录）

靶向药物

贝伐单抗（安维汀）

VEGFR2mRNA、VEGFmRNA

激素类

药物

来曲唑（芙瑞）、阿那曲唑（艾达）

CYP19A1SNP、CYP19A1SNP、HER-2mRNA

他莫昔芬

CYP2D6SNP

化疗药物

卡铂、顺铂、奥沙利铂

ERCC1mRNA、BRCA1 mRNA、ERCC1SNP、XRCC1SNP、GSTM1SNP、GSTP1SNP

紫杉醇、多西紫杉醇

TUBB3mRNA、STMN1mRNA、GSTP1SNP

吉西他滨（泽菲）

RRM1mRNA

5-FU、卡培他滨

MTHFRSNP、DPDSNP、TSmRNA

培美曲塞

TSmRNA、TYMSSNP

依托泊苷

UGT1A1SNP、MGMT甲基化

伊立替康

UGT1A1SNP

胰腺癌

药物

检测基因（具体检测项目见后面目录）

靶向药物

厄洛替尼（特罗凯）、吉非替尼（易瑞沙）

（血）EGFR突变、（血）K-ras突变、EGFR拷贝数

化疗药物

5-FU、卡培他滨

MTHFRSNP、DPDSNP、TSmRNA

卡铂、顺铂、奥沙利铂

ERCC1mRNA、BRCA1 mRNA、ERCC1SNP、XRCC1、GSTM1SNP、GSTP1SNP

吉西他滨（泽菲）

RRM1mRNA

肾透明细胞癌

药物

检测基因（具体检测项目见后面目录）

靶向药物

索拉菲尼（多吉美）、舒尼替尼（索坦）、

贝伐单抗（安维汀）

VEGFR2mRNA、PDGFRαmRNA

化疗药物

吉西他滨（泽菲）

RRM1mRNA

5-FU、卡培他滨

MTHFRSNP、DPDSNP、TSmRNA 

脑胶质瘤

药物

检测基因（具体检测项目见后面目录）

靶向药物

厄洛替尼（特罗凯）、吉非替尼（易瑞沙）

（血）EGFR突变、（血）K-ras突变、EGFR拷贝数

拉帕替尼

PIK3CA突变

化疗药物

替莫唑胺

MDR1SNP

卡莫司汀、司莫司汀

ERCC1mRNA、ERCC2mRNA

甲氨蝶呤

MTHFRSNP

吉西他滨（泽菲）

RRM1mRNA

依托泊苷

UGT1A1SNP、MGMT甲基化

5-FU、卡培他滨

MTHFRSNP、DPDSNP、TSmRNA

环磷酰胺

CYP2C9SNP

分子靶向药物个体化用药检测目录

靶向药物

项目名称

方法

适用样本

注解

特罗凯

-厄洛替尼

易瑞沙

-吉非替尼

EGFR突变多态性5项

测序

组织、胸腹水、全血等

In1（CA）n重复≤16-疗效↑

Ex18、19、21突变-疗效↑

Ex20/T790M突变-耐药↑

EGFR突变-36个位点

qPCR-ARMS

组织、胸腹水

血EGFR突变-36个位点

HRM/测序

全血、胸腹水等

血EGFR突变-20/T790M

HRM

全血、胸腹水等

EGFR拷贝数

FISH

白片、组织

扩增-疗效↑

克卓替尼

EML4-ALK融合基因

PCR

石蜡组织

阳性-疗效↑

爱必妥、特罗凯

、易瑞沙等

K-ras突变-12、13

测序

组织

突变-疗效↓、预后↓

血K-ras突变-12、13

HRM

全血、胸腹水等

EML4-ALK融合基因

爱必妥

-西妥昔单抗

维克替比

-帕尼单抗

B-raf突变-V600E

测序

组织

突变-疗效↓

血B-raf突变

HRM

全血、胸腹水等

PIK3CA突变-9、20

测序/qPCR

组织、胸腹水、全血等

突变-疗效↓

PTENmRNA

qPCR

组织*预约

表达高-疗效↑

安维汀-贝伐珠单抗、阿瓦斯汀

VEGFmRNA

qPCR

组织*预约

表达高-疗效↑

VEGFR2mRNA

qPCR

组织*预约

表达高-疗效↑

多吉美-索拉非尼、索坦-舒尼替尼

VEGFR2mRNA

qPCR

组织*预约

表达高-疗效↑

PDGFRαmRNA

qPCR

组织*预约

表达高-疗效↑

格列卫-伊马替尼

C-Kit-9、11、13、17

测序

组织

突变-疗效↑

PDGFRα突变-12、18

测序

组织

突变-疗效↑

格列卫、达沙替尼、尼罗替尼

ABL突变-T315I

HRM

全血、骨髓血

慢粒：

突变-疗效↓

赫赛汀-曲妥珠单抗、拉帕替尼

HER2拷贝数

FISH

白片、组织

扩增-疗效↑

PIK3CA突变-9、20

测序/qPCR

组织、胸腹水、全血等

突变-疗效↓

检测套餐

项目名称

方法

适用样本

注解

肺癌套餐-组织

（特罗凯、爱必妥等）

EGFR突变5项、K-ras、B-raf突变

测序

组织

In1（CA）n重复≤16-疗效↑

Ex18、19、21突变-疗效↑

Ex20/T790M突变-耐药↑

K-ras、B-raf突变-疗效↓

肺癌套餐-血

（特罗凯、爱必妥等）

血EGFR-36个位点、K-ras、B-raf突变

HRM/

Cold-PCR

全血、穿刺组织、胸腹水等

肺癌动态-血

（继发耐药）

血EGFR20/T790

K-ras、B-raf突变

HRM/

Cold-PCR

全血、胸腹水等

EGFR-20/T790M突变-耐药↑

K-ras、B-raf突变-疗效↓

乳腺癌21基因

+复发风险评估

21基因表达量

qPCR

组织*预约

低风险  中风险  高风险：

RS≤18 18

化疗药物个体化用药检测目录

检测套餐

方法

适用样本

检测靶标

评价

注解

铂类-卡铂、顺铂、奥沙利铂等

氟类-5-FU、卡培他滨等

蒽环类-阿霉素、表柔比星等

喜树碱类-艾力、伊力替康等

抗微管类-紫杉醇、长春碱等

甲氨喋呤等

依托泊苷、拓扑替康等

焦磷酸测序

全血EDTA抗凝2ml

ERCC1SNP-C118T

疗效

C/C>C/T、T/T

XRCC1SNP-R399Q

G/G>G/A、A/A

GSTM1SNP

缺失-/->+/+

GSTP1SNP-I105V

G/G、G/A>A/A

MTHFRSNP-C677T

T/T>C/C

DPDSNP-IVS14+1G>A

毒性

A/A>A/G>G/G

UGT1A1SNP-28TA

6/7TA、7/7TA>6/6TA

化疗药物

项目名称

方法

适用样本

评价

注解

铂类

-卡铂、顺铂、奥沙利铂

ERCC1mRNA

qPCR

组织

疗效

表达低>表达高

BRCA1 mRNA

qPCR

组织

疗效

表达低>表达高

ERCC1SNP-C118T

测序

全血

疗效

C/C>C/T、T/T

XRCC1SNP-R399Q

测序

全血

疗效

G/G>G/A、A/A

GSTM1SNP

测序/qPCR

全血

疗效

缺失-/->+/+

GSTP1SNP-I105V

测序/qPCR

全血

疗效

G/G、G/A>A/A

氟类

-5-FU、卡培他滨

MTHFRSNP-C677T

测序

全血

疗效

T/T>C/C

DPDSNP-IVS14+1G>A

测序

全血

毒性

A/A>A/G>G/G

5-FU

HPLC

全血*预约

浓度

药物血浓度监测

TYMS（TS）mRNA

qPCR

组织

疗效

表达低>表达高

培美曲赛

-力比泰

TYMS（TS）mRNA

qPCR

组织

疗效

表达低>表达高

TYMSSNP-2R/3R

qPCR

组织

疗效

3R/3R>2R/2R、2R/3R

蒽环类-（表）阿霉素、表柔比星、多柔比星

GSTP1SNP-I105V

测序/qPCR

全血

疗效

G/G、G/A>A/A

MDR1SNP-C3435T

qPCR

全血*预约

疗效

T/T>C/C、C/T

抗微管类

-紫杉醇、长春碱

TUBB3mRNA

qPCR

组织

疗效

表达低>表达高

STMN1mRNA

qPCR

组织*预约

疗效

表达低>表达高

GSTP1SNP-I105V

测序/qPCR

全血

疗效

G/G、G/A>A/A

泽菲-吉西他滨

RRM1mRNA

qPCR

组织

疗效

表达低>表达高

喜树碱类-艾力、伊力替康

UGT1A1SNP-28TA

测序

全血

毒性

6/7TA、7/7TA>6/6TA

阿那曲唑-艾达

来曲唑-芙瑞

CYP19A1SNP-rs4646

qPCR

全血

疗效

G/T、T/T>G/G

CYP19A1SNP-rs10046

G/G>G/A、A/A

环磷酰胺

CYP2C9SNP-C430T

qPCR

全血

疗效

C/C、C/T>T/T

CYP2C9SNP-A1075C

A/A、A/C>C/C、

甲氨蝶呤

MTHFRC677T

测序

全血

毒性

T/T>C/C

依托泊苷、拓扑替康

UGT1A1SNP-28TA

qPCR

全血

毒性

6/7TA、7/7TA>6/6TA

MGMT甲