欧洲药典100 2246 6 色谱分离技术Word文件下载.docx
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洗脱出某一组分所需的流动相体积。
可使用下面公式,通过保留时间和流速(F),单位毫升每分钟,来计算:
VR=tR×
F
滞留时间(tM)
洗脱出非保留组分所需的时间(图2.2.46.-1,基线刻度以分钟表示)。
尺寸排阻色谱中使用符号t0表示(见下文)。
滞留体积(VM)
洗脱出非保留组分所需的流动相体积。
可使用下面公式,通过滞留时间和流速(F),单位毫升每分钟,来计算:
VM=tM×
尺寸排阻色谱中使用符号V0表示(见下文)。
图2.2.46.-1
保留因子(k)
按下式定义保留因子(亦即质量分布比率(Dm)或容积因子(kˊ)):
KC=分配常数(亦即平衡分布系数);
VS=固定相体积;
VM=流动相体积。
可用下列公式从色谱图中确定某一组分的保留因子:
总流动相时间(tt)
尺寸排阻色谱中,分子比最小凝胶孔径还小的组分的保留时间(图2.2.46.-2)。
总流动相体积(Vt)
尺寸排阻色谱中,分子比最小凝胶孔径还小的组分的保留体积。
可使用下面公式,通过总流动相时间和流速(F),单位毫升每分钟,来计算:
Vt=tt×
图2.2.46.-2
非保留化合物的保留时间(t0)
尺寸排阻色谱中,分子比最大凝胶孔径还大的组分的保留时间(图2.2.46.-2)。
非保留化合物的保留时间(V0)
尺寸排阻色谱中,分子比最大凝胶孔径还大的组分的保留体积,使用下面公式,通过总流动相时间和流速(F),毫升每分钟,来计算:
V0=t0×
分配常数(K0)
尺寸排阻色谱中,特定的柱子中的某一组分的洗脱特性可通过分配常数给出(也称为分配系数),可用下列公式计算:
滞留因子(RF)
用于平面色谱的滞留因子(亦即保留因子(Rf))是指点样点至斑点中心的距离与前端溶剂从点样点处迁移的距离的比率(图2.2.46.-3)。
b=组分的迁移距离;
a=前端溶剂的迁移距离。
A前端流动相B斑点C起始点样线
图2.2.46.-3
塔板数(N)
柱效(表观效率)可通过要么在等温、等梯度条件下,要么在等密度条件下(取决于技术的不同)获得的数据计算得到,该数据以塔板数,亦称为理论塔板数来表示。
用下列公式计算塔板数,tR和Wh的值用同一单位表示:
tR=组分对应峰的保留时间;
Wh=半峰高处的峰宽。
塔板数因组分的不同而不同,也会因色谱柱、柱温、流动相和保留时间的不同而不同。
滞留体积(D)
滞留体积(亦即梯度滞后体积)是指洗脱液交汇的点至色谱柱顶端之间的体积,可用下列程序测定。
柱子:
用一根合适的毛细管柱(例如,1m×
0.12mm)代替色谱柱。
流动相:
—流动相A:
水R;
—流动相B:
0.1%(V/V)丙酮R溶液;
时间
(min)
流动相A
(%,V/V)
流动相B
0—20
100→0
0→100
20—30
100
流速:
设置流速以获取足够的反压(例如,2ml/min)。
检测:
265nm处分光光度法检测
测定当吸光值增加了50%时的时间(t0.5),单位min(图2.2.46.-4)
tD=t0.5-0.5tG(min);
tG=预定义梯度时间(=20min);
F=流速(mL/min)。
图2.2.46.-4
对称因子(AS)
色谱峰的对称因子用下列公式计算(图2.2.46.-5):
w0.05=峰高1/20处的峰宽;
d=色谱峰最高点的垂线至峰高1/20处峰前缘之间的距离。
AS值为1.0表示堆成,当AS>
1.0,则峰拖尾;
当AS<
1.0,则峰靠前。
图2.2.46.-5
分离度(RS)
两种组分的色谱峰之间的分离度(图2.2.46.-1)可用下列公式计算:
tR2>
tR1
tR1,tR2=色谱峰的保留时间;
wh1,wh2=半峰高的峰宽。
使用密度测定法的定量平面色谱中,用迁移距离代替保留时间,则两种组分的色谱峰之间的分离度可以用下列公式计算:
RF1,RF2=色谱峰的滞留因子;
wh1,wh2=半峰高处的峰宽;
a=前端溶剂的迁移距离。
峰谷比(p/v)
图2.2.46.-6
峰谷比可以作为在相关物质检测中,当两个色谱峰的基线没有分开时的系统适用性标准(图2.2.46.-6)。
Hp=外推基线上面的较小色谱峰的峰高;
Hv=外推基线上部的分开较小和较大色谱峰的曲线的最低点的峰高。
相对保留(R)
相对保留用于估算,可用下列公式计算:
tRi=所关注色谱峰的保留时间;
tRst=参照色谱峰的保留时间(通常为待检查物质对应的色谱峰);
tM=滞留时间。
未调整过的相对保留(rG)可用下列公式计算:
除非另有说明,各论中叙述的相对保留值对应于未调整过的相对保留值。
平面色谱中,用滞留因子RFst和RFi代替tRst和tRi。
信噪比(S/N)
短期的噪音影响定量的准确性。
按下列公式计算信噪比:
H=在用规定的参考溶液获得的谱图中,所关注组分对应的色谱峰的峰高(图2.4.46-7),该峰高为测量从色谱峰的最大值到至少5倍半峰高处的峰宽的长度下观察到的信号的外推基线的高度。
h=在用规定的参考溶液获得的色谱图中,观察至少等于5倍半峰高处峰宽的长度,而且,如有可能,定位于可检测到色谱峰的周围相等的时间长度,在空白进样后得到的色谱图中噪音的范围。
图2.2.46.-7
系统重复性
用不少于3次参考溶液进样的以连续系列的测量的相对标准偏差(Sr(%))的百分数的估计值表示响应的重复性,可用下列公式计算:
yi=为各个峰面积、峰高或内标法中峰面积比率的值;
=为各个值的平均数;
n=各个值的数目(进样的次数)。
系统适用性
所使用装置的各个不同的部件必须是合格的,且能用于完成检验或含量测定所要求的操作。
系统适用性检验是该方法不可或缺的一部分,并用于确保色谱系统具有合适的性能。
表观效率、保留因子(质量分配比率)、分离度和对称因子这些参数通常用于评价柱子的性能。
可能影响色谱行为的因数包括:
—流动相的组成、离子强度、温度和表观pH值;
—流速、色谱柱尺寸、柱温和柱压;
—固定相性质,包括色谱承载物的类型(基于粒子的或整体的)、粒径或大孔的尺寸、孔隙率、比表面积;
—反相及固定相的其他表面修饰,化学修饰的程度(例如封尾、碳填充等)。
除另有说明外,下面的要求和各论给出的某些补充要求也同样要满足:
—在一个相关物质试验或含量测定中,除另有说明外,在用于定量的参考溶液获得的色谱图中,一个峰的对称因子为0.8~1.5。
—在纯度为100%的活性物质含量测定时,参考溶液一系列进样的最大允许相对标准偏差(Sr(%)max)的确切限度可通过下列公式计算:
K=常数(0.349),计算表达式得到,式中代表
B=1.0时,进样6针后要求的相对标准偏差的百分数;
B=各论在定义中给出的上限减去100%;
N=参考溶液重复进样的次数(3≤n≤6);
t90%,n-1=自由度为n-1的t检验90%置信水平(双侧)。
除另有说明外,最大允许相对标准偏差不得超过表2.2.46.-1给出的适当值,该要求不适用于相关物质的检验。
表2.2.46.-1重复性要求
单独进样次数
3
4
5
6
B(%)
最大允许相对标准偏差
2.0
0.41
0.59
0.73
0.85
2.5
0.52
0.74
0.92
1.06
3.0
0.62
0.89
1.10
1.27
—在相关物质检验中,定量的限度(对应于信噪比为10)等于或小于可忽略限度。
色谱程序的整个过程中均要求符合系统适用性标准。
依赖于不同的因数,例如程序使用的频率和色谱系统的经历,分析者选择合适的验证计划以检测之。
色谱条件的调整
色谱检验中不同的参数,在方法没有根本改变的情况下,可能要调整以满足系统适用性标准,其调整范围在下面列出。
通过梯度洗脱来调整色谱条件比通过等度洗脱来调整色谱条件更关键,因为它可能导致峰漂移至一个不同的梯度,从而导致峰的不正确分配,以及掩盖或者峰的漂移致使洗脱时间超过所规定的洗脱时间。
方法中改变的部分而不是标明的部分需要重新验证。
在建立各论的过程中,所描述的色谱条件已经得到验证。
这是已达到检验和含量测定的良好性能所需要的分离效果中包含了系统适用性检查。
然而,因为固定相是以一般的方式描述,而商业上可用的具有不同色谱行为的固定相很多,所以有必要对色谱条件进行某些调整,以使其达到所规定的系统适用性要求。
特别地,对于反相液相色谱,不同参数的调整并不能总是得到满意的色谱。
在这种情况下,有必要使用能表现所需的色谱行为的另一根同种类型的柱子(例如,碳十八硅胶)代替该色谱柱。
EDQM网站中的Knowledge数据库通常包含有在各论建立过程中使用的色谱柱的信息。
对于关键参数,各论中已明确定义了这些参数的调整以确保系统适用性。
薄层色谱和纸色谱
流动相组成:
对其中较少的溶剂组分的量,调整范围为相对差值±
30%或绝对差值±
2%,选其中较大的一种;
对于占流动相10%的较少组分,30%的相对调整允许在7-13%范围内,而2%的绝对调整允许在8-12%范围内,相对值因而是较大者;
对于占流动相5%的较少组分,30%的相对调整允许在3.5-6.5%范围内,而2%的绝对调整允许在3-7%,这种情况下,绝对值因而为较大的组分;
任何组分的调整绝对值不得超过±
10%。
流动相水溶液组分的pH:
除另有说明外,±
0.2pH,或当检查的是非电离物质时,±
1.0pH。
流动相中缓冲组分的盐浓度:
±
上样体积:
如果使用细微的粒径(2-10um),则为所规定体积的10-20%。
液相色谱:
等度洗脱
2%,选其中较大的一种(参见上述例子),但任何组分的绝对值不得超过±
50%;
但当色谱柱尺寸改变时,更大范围的调整是可以接受的(见下面的公式)。
色谱柱参数
固定相:
—固定相取代基的本性不允许改变(例如,C18不能用C8代替);
—粒径:
最大减小量为50%,不允许增大。
色谱柱尺寸:
—长度:
70%
—内径:
25%。
当色谱柱尺寸改变后,有必要用下列公式调整流速:
F1=各论标明的流速,mL/mL;
F2=调整后的流速,mL/mL;
l1=各论标明的色谱柱长度,mm;
l2=使用的色谱柱长度,mm;
d1=各论标明的色谱柱内径,mm;
d2=使用的色谱柱内径,mm;
温度:
除另有说明外,当指定柱温时,±
10℃。
检测器波长:
不允许调整。
进样体积:
倘若要测定的色谱峰的检测和重复性良好,可以减少;
但不允许增加。
梯度洗脱
相比于等度洗脱,梯度色谱系统条件的调整要求更加小心。
流动相组成/梯度洗脱:
流动相组成和梯度的较小调整是可以接受的,假设:
—系统适用性要求完全满足;
—主要色谱峰在指定保留时间的±
15%内被洗脱出来;
—流动相最终组成的洗脱能力不弱于规定组成的洗脱能力。
如果系统适用性要求不能达到时,优先考虑死体积或更换色谱柱。
死体积:
所用装置的构造可能显著地改变所描述的分离度、保留时间和相对保留,如果这些发生了,可能是由于过量的死体积引起。
考虑到方法开发所用系统与实际使用的系统的死体积不同,各论会选择在梯度程序开始之前,包含一个等度洗脱步骤,使梯度时间点能适应。
使用者有责任使等度洗脱步骤的长度适应所用的分析装置。
如果在各论建立过程中使用的死体积在各论中给出,则梯度洗脱表指明中的时间点(tmin)可由适应的时间点(tcmin)代替,使用下列公式计算tc:
D=死体积,mL;
D0=方法开发中使用的死体积;
F=流速,mL/min。
如果有验证数据支持没有等度洗脱步骤的方法也是可行的,那么用于此目的的等度步骤可以省略。
当色谱柱尺寸改变时,调整是可以接受的(见下面的公式)。
不允许改变。
F1=各论标明的流速,mL/mL;
l2=使用的色谱柱长度,mm;
d2=使用的色谱柱内径,mm;
除另有说明外,当指定操作温度时,±
5℃。
气相色谱
最大减少量为50%;
不允许增加(填充柱);
—膜厚度:
-50%至+100%(毛细管柱)。
50%。
进样体积和分流体积:
倘若检测和重复性良好,可以调整。
超临界流体色谱
对于填充柱,较少的溶剂组分的量的调整范围为相对差值±
2%,选其中较大的一种,但毛细管柱系统不允许调整。
检测波长:
25%(填充柱)。
50%(毛细管柱)。
当指定操作温度时,±
倘若检测和重复性良好,可以减少,但不允许增加。
定量
在定量过程中不考虑由溶剂和试剂,或流动相、样品基质引起的色谱峰。
—检测器灵敏度:
检测器灵敏度是指进入检测器的流动相中,某种物质每单位浓度或单位质量输出的信号。
相对检测器响应因子,通常称为响应因子,表示检测器对于一给定的与一种标准物质相关的物质的灵敏度。
校正因子是响应因子的倒数。
—外标法:
通过比较由供试溶液获得的响应(峰)与由参考溶液获得的响应(峰)来测定待分析组分的浓度
—内标法:
将等量的要溶解于待检查物质的一种组分(内标)分别加入供试溶液和参考溶液中。
内标的选择原则:
不与待检查物质发生反应,稳定且不含有保留时间与带检查物质保留时间相同的杂质。
通过比较供试溶液中待检查物质引起的色谱峰峰面积或峰高与内标引起的色谱峰峰面积或峰高的比率,与参考溶液中待检查物质引起的色谱峰峰面积或峰高与内标引起的色谱峰峰面积或峰高的比率,来测定待检查物质的浓度。
—归一化程序:
通过测定对应峰的峰面积占所有峰(包括由溶剂、试剂、或由流动相和样品基质引起的色谱峰,及位于可忽略限度或限度以下的色谱峰)的峰面积之和的百分数,来计算待检查物质中某一组分的百分含量。
—校正程序:
确定测量的或估算的信号(y)与物质的数量(x)(浓度、质量等)之间的关系,并计算其校正函数。
通过反函数的方法,从被分析物的测量信号来计算分析结果。
对于外标法:
(当供试溶液的稀释液用于比较时)外标法和归一化法,在相关物质的检验中,均需应用各论中标明的一些校正因子(例如,当响应因子在0.8-1.2范围以外时)。
当相关物质检验规定了总的杂质或要对某一杂质进行定量测定时,对峰面积积分来说,选择一个合适的阈值设定和合适的条件是非常重要的。
在这种检验中,可忽略限度(例如,在该限度或该限度以下的峰可以忽略不计)一般为0.05%。
与主峰未完全分离的杂质峰面积的积分优先采用峰谷外推法(切线跳跃)。
日期
修订人
版次号
修订内容
法定依据及有效日期
2009年3月15日
罗时远
A
原版
EP6.0(2008年1月1日—2009年3月31)20)
2010年7月15日
侯付景
B
内容大篇幅调整
EP6.4(2009年4月1日—2016年6月30日)
2016年7月1日
吕珊
C
升版
EP8.8(2016年7月1日—)