碱性蛋白发酵工艺设计Word文档下载推荐.doc
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3.6.4无菌空气的质量标准 10
3.6.5无菌空气的制备 10
3.7发酵 11
3.8分离纯化 12
4工艺计算 12
4.1碱性蛋白酶发酵工艺技术指标 12
4.2工艺参数与基本物性数据的选取 12
4.2.1工艺参数 12
4.2.2基本物性数据的选取 13
4.3物料衡算 13
4.4热量衡算 14
4.4.1基准温度的选定 14
4.4.2连消塔的热量衡算 14
4.4.3发酵罐的热量衡算 14
5分离干燥 14
5.1双水相萃取 14
5.2干燥 15
6后记 16
参考文献：
17
1绪论
1.1碱性蛋白酶概述
碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白酶的能力。
生产工艺是采用微滤超滤膜分离、喷雾干燥或真空冷冻干燥等先进技术，广泛应用于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。
碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢，具有独特的洗涤效果。
碱性蛋白酶在技术采用细菌原生质体诱变处理方法，从国内碱性蛋白菌生产菌2709枯草杆菌中研究选育出若干稳定高性能菌株，在后处理上，采用去渣盐析沉淀法，减少了蛋白酶的杂质含量和产品特有的气味，提高了溶解速度，与洗涤剂有更好的配伍性，延长了保质期。
目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶种中用得最多的一种酶，约占酶总量的60%，其中碱性蛋白酶就占25%.它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用，吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究。
1.2碱性蛋白酶的性质
碱性蛋白酶外观为褐色粉末，有酵曲的特殊臭味，能够分解蛋白质分子中的肽键成为小分子的氨基酸和肽。
碱性蛋白酶是由造育的地衣芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300.
1.3碱性蛋白酶的使用条件
底物浓度10—25%，温度50—60℃，pH值9—11，反应时间3—6小时（根据要求可长可短），添加酶0.03—0.06%（以水解溶液重量计）。
1.4碱性蛋白酶的保存
5℃保藏，保质期一年；
25℃储存，酶活保存期至少3个月以上。
1.5注意事项
（1）此产品可完全溶于水，使用安全可靠。
操作时请勿直接与酶制剂接触，若有接触需及时用清水冲洗。
（2）原包装打开后尽快食用，剩余部分需扎口保存。
（3）本品在贮存中要避免雨淋和曝晒，禁止与有毒有害物质混运混存。
1.6碱性蛋白酶的主要应用
1.6.1在洗涤剂中的应用
日常生活中遇到的污垢，特别是衣服上的污垢组成是十分复杂的，一般来说，主要有尘土的微粒、人体分泌的皮脂和汗液、食物的汁液和残余物等，有机污垢是以蛋白质与纤维结合的方式存在的。
用于洗涤这些污物的洗涤剂是由表面活性剂、纯碱、水玻璃（硅酸盐）、三磷酸盐等配制而成，洗涤时水溶液显示出较高的碱性pH一般在9-11之间，在这种条件下，碱性蛋白酶正好可以发挥其催化活性，催化污物中的蛋白质水解，使复杂的蛋白质分解成结构简单、相对分子量较小的水溶性肤，或者进一步分解为氨基酸。
这样，原来粘在衣物上的其它污物也可以一起被洗下来。
在整个洗涤过程中，碱性蛋白酶可反复起分解蛋白质的作用，只是酶活越来越低。
1.6.2在皮革中的应用
我国皮革工业资源丰富，发展十分迅速，猪、羊皮产量居世界之首。
猪、牛、羊皮制革时，首先要除去皮上的毛，然后才能进一步加工蹂制成革。
过去脱毛工艺沿用石灰、硫化钠浸渍，不仅时间长，工序多，而且劳动强度大，污染严重。
采用蛋白酶脱毛是利用酶分解毛、表皮同真皮层连接处的蛋白质，从而使毛同皮的联结松开而脱毛。
目前，我国的皮革制品不仅满足了国内市场的需求，还大量出口创汇。
另外，在猪皮加工的包酶阶段，因皮液系统pH值约在10士0.5之间，故常用碱性蛋白酶进行局部处理
1.6.3在饲料添加剂中的应用
猪、禽等单胃动物消化道的内源酶系不全;
幼龄畜禽缺乏淀粉酶、糖化酶和蛋白酶：
处于疾病的畜禽，其内源酶（如淀粉酶、蛋白酶等）急剧下降。
动物饲料是以淀粉、蛋白质等大分子化合物作为营养源，不同动物消化道中的酶系不同，数量也很有限，再加上饲料在消化道中停留的时间一般都很短，饲料往往未被充分消化就随粪便排出体外，造成部分浪费。
据研究，不少动物对饲料的消化吸收率仅20%左右。
在饲料中添加酶制剂就可以与动物内源酶发挥协同作用，将难消化吸收的蛋白质、淀粉等大分子化合物降解为氨基酸、肤、脉、单糖、寡糖等小分子物质，从而提高饲料的消化率和利用率，并提高畜禽及鱼类的生产性能，同时可以减少畜禽排泄物中氮、磷的排泄量，保护水体和土壤免受污染。
饲用酶制剂多为复合酶，由非内源消化酶和内源消化酶两大类组成。
非内源消化酶包括木聚糖酶、p-葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶等，内源消化酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
其中蛋白酶是主要成分，可将饲料中的蛋白质分解多肽及游离氨基酸，从而提高饲料的利用率。
1.6.4在纺织行业的应用
在纺织工业中应用碱性蛋白酶可一定程度的取代强碱等有毒有害物质，为减少污染、保护生态环境提供经济有效的方法。
特别是在羊毛减量加工和丝绸精炼脱胶等方面具有广泛应用，使用碱性蛋白酶可以解决羊毛仿羊绒物质的生硬、粗糙等问题，并能改善和提高丝绸与棉、麻、毛等纤维混纺产品的手感和风格，增加羊毛产品的附加值。
1.6.7在玉米深加工中的应用
玉米黄粉是玉米湿法淀粉厂的副产品，其中含有40%-60%的蛋白质，这些蛋白质大部分是醇溶蛋白、谷蛋白和球蛋白。
玉米醇蛋白具有大区域的a-螺旋结构，N-末端有很强的疏水性，是高憎水蛋白，因此只能溶于异丙酮和乙醇中，不溶于水。
谷蛋白只溶于碱水溶液。
因此与其它商业化蛋白源相比，玉米蛋白的疏水性使得其食品功能特性极差。
要想使蛋白质具有理想的食品功能，就必须使其成为水溶解状态或处于较好的悬浮状态。
为了提高玉米蛋白的水溶性以制备一些特殊产品，用碱性蛋白酶修饰玉米蛋白使其成为可溶性肤的研究成为热点。
王梅谷等对碱性蛋白酶水解玉米蛋白的反应动力学进行了研究，探索了酶法修饰玉米蛋白的可行性，在适宜的反应体系中，可大幅度提高酶促玉米蛋白的溶解量。
为玉米黄粉的食品工业应用和饲料营养的特殊要求提供可靠的依据。
玉米鼓质白质具有独特的氨基酸组成，使它成为多种生理活性功能肤的良好天然来源。
1.7碱性蛋白酶的发展前景
蛋白酶是一种重要的工业用酶，占世界酶制剂销售量的60%以上。
上世纪五十年代蛋白酶的主要来源是植物的木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶和动物内脏，而微生物来源的蛋白酶一经研究，因具有培养简便，耗时短，产量丰富等优点，应用尤为广泛，被认为是最重要的酶资源。
水解蛋白的最适PH在碱性范围内的蛋白酶称为碱性蛋白酶。
它在工业上具有巨大的应用潜力，如洗涤剂、皮革制造、食品加工、制药以及废物处理等工业中，碱性蛋白酶的使用能显著改善产品品质，大大减少了对环境的污染，节约成本，为传统的行业和生产带来了一场革命。
尤其是作为无磷洗衣粉的添加剂使用，已使碱性蛋白酶商业制剂的销售占整个蛋白酶市场的1/3。
由于碱性蛋白酶作用环境的特殊性，要求其在极端的条件下具有较高的蛋白质水解活力。
其克服不良环境的能力愈强，应用愈广泛，愈能耐受恶劣的工业条件。
2设计任务
2.1设计内容
包括菌种选育、培养基的设计及灭菌、空气除菌（如为需氧发酵）、种子的扩大培养、发酵过程中的控制参数和下游加工等，并由此形成一套完整的生产工艺。
2.2设计要求
按照年产量要求进行工艺设计，不得造成设备浪费，节约人力、物力和能源。
进行简单的物料衡算。
绘制设计图，要求至少一张工艺流程图和一张主设备结构图，A4纸。
3碱性蛋白酶生产工艺选择
3.1生产工艺的选择
采用液态深层发酵
3.2工艺流程图
空气菌种培养基离心分离PEG盐
预热冷冻干燥
除菌
连消 产品
无菌空气二级种子 维持
降温
发酵液
高压匀质机
离心分离
废液项 PEG水相
3.3工艺流程图说明
3.3.1菌种的制备
选择枯草芽孢杆菌2709，经过分离、选育、纯化和鉴定后成为菌种。
菌种可用沙土管保存，若有条件可采用液氮超低温保存。
3.3.2孢子的制备
（1）制备母液斜面孢子
将保存在冰箱中的沙土孢子，在无菌超净工作台上接种于以灭菌的斜面培养上于37℃培养9-10天，放入2-6℃冰箱中备用。
（2）制备子瓶斜面孢子
将生长好且在冰箱存放一周以上的母瓶取出，制成菌悬液接种于子瓶斜面上，于37℃恒温培养8-9天，培养好的子斜面侧摇瓶效价合格后保存在2-6℃冰箱中备用。
3.3.3种子的制备
其目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进行逐级扩大培养。
以微孔压差法或打开接种口在火焰保护下接种。
接种量视需要而定，在罐内培养过程中需要搅拌和通入无菌空气。
控制罐温、罐压，并定时取样做无菌试验，观察菌丝形态，测定种子液中发酵单位和进行生化分析，并观察有无杂菌的情况种子质量合格后移到发酵罐中。
3.4菌种的改良
菌种改良的方法有很多，最常用的方法有诱变育种。
诱变育种的原理：
是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。
诱变的方法：
A:
物理方法：
射线（紫外线、X光线、Y射线，中子线），激光微束，离子束，微波，超声波，热力等。
B:
化学诱变常用方法：
浸渍法、涂抹法、滴液法、注射法、施入法和熏蒸法。
化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂，移码诱变剂，硫酸二乙酯（DFS）、5-溴尿嘧啶（5－BU）、氮芥（Nm）。
C:
生物方法：
空间条件处理诱变，病原微生物诱变，转基因诱变。
出发菌株
诱变育种的过程
原种特性考察
斜面
制备单孢子菌悬液
做活菌计数，统计存活率
诱变处理
观察菌株形态
稀释涂平板
挑取单菌落传种斜面
摇瓶初筛
挑出高产斜面
埋制沙土管
留种保藏
传种斜面
复筛，摇瓶次数
摇瓶复筛
挑出高产菌株做稳定性试验和菌种特性考察
放大罐试验，中试考察
大型投产
3.5培养基的制备
培养基是指可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，同时也为微生物生长提供除营养外的其他生长所需的条件。
原则上①必须含有细胞组成所必须原料；
②满足一般生化反应的基本条件（温度、溶氧和批pH）；
③来源丰富、价格低廉、取材方便、质量稳定；
④培养基成分性质稳定不影响下游产品的提取加工。
培养基按照用途可以分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。
孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长迅速,产生数量多而且优质的孢子,并且不会引起菌体变异。
所以孢子培养基的配置要求如下：
①培养基的营养不要太丰富，特别是有机氮源要低一些，否则孢子不易形成。
②无机盐的浓度要适当,不然会影响孢子的颜色和数量。
③应注意培养基的pH值和湿度。
3.6灭菌的方法
常用的灭菌方法有：
化学灭菌；
射线灭菌；
干热灭菌；
湿热灭菌和过滤除菌等。
影响灭菌效果的因素：
①微生物的种类和数量，②培养基性质、浓度、成分，③灭菌的温度、时间。
本实验采用湿热灭菌。
湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌。
由于蒸汽有很强的穿透力，而且冷凝时放出大量的冷凝热，很容易是蛋白质凝固而杀灭各种微生物。
通常蒸汽灭菌的条件是在121℃（表压约0.1MPa）维持30min。
3.6.1湿热灭菌
对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡速率与残存数量成正比，即（3—1）
式中：
N培养基中活微生物的个数；
τ为微生物受热时间，s；
κ为比死亡速率，；
若开始灭菌时（τ=0），培养基中或微生物数为N0，将式（3—1）积分可得
（3—2）
上式被称为对数残留定律。
其中N为经τ时间灭菌后培养基中活微生物数。
3.6.2培养基的连续灭菌
培养基连续灭菌在短时间内被加热到灭菌温度（130～140）,短时间保温（一般为5～8min），升降温时间相对较短，可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量平稳等优点，培养基在短时间内被加热到灭菌温度，短时间保温后被快速冷却，再进入早已灭完菌的发酵罐，这样不但可以节省时间，更重要的是减少了培养基的破坏率。
对补料培养基的灭菌方法跟发酵培养基的灭菌方法一样都是湿热灭菌，其加热蒸汽的压力要求较高，一般不小于0.45Mpa.连续灭菌的流程，如图所示
3.6.3空气除菌
根据国家药品质量管理规范的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。
3.6.4无菌空气的质量标准
国家所规定无菌空气的质量标准为：
1、连续提供一定流量的压缩空气。
2、空气的压强为0.2~0.4Mpa。
3、进入过滤器前空气的相对湿度应小于等于70.4、进入发酵罐的空气温度可比培养基温度高10~30℃左右。
5、压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器时，一般取失败概率为0.001为指标。
3.6.5无菌空气的制备
过滤是空气除菌的主要手段，按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类：
绝对过滤，深层过滤。
后者主要原理为：
1、惯性滞留作用2、拦截滞留作用3、布朗扩散作用4、重力沉降5、静电作用。
其过滤除菌流程为：
采风塔→粗过滤器→空气压缩机→空气储存罐→冷却器→气液分离设备→空气加热设备→空气过滤设备。
如图5-1。
图5-1空气除菌设备流程图
设备如下：
①采风塔：
采风塔建在工厂的上风头，远离烟囱，采风塔越高越好，高至少10m,气流速度8m/s。
②粗过滤器：
安装在空压机吸入口前，主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。
应阻力小，容量大。
③空气压缩机：
作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。
④空气储罐：
作用是消除压缩空气的脉动。
要求：
H/B=2～2.5，V=（0.1～0.2）V1
其中，H为罐高；
B为罐直径；
V1为空压机每分钟排气量（20℃，1×
105Pa状况下），
⑤旋风分离器：
是利用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。
作用是分离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。
⑥冷却器：
空压机出口温度气温在120℃左右，必须冷却。
另外在潮湿的地域和季节还可以达到降湿的目的。
空气冷却器可采用列管式热交换器空气走
壳程，管内走冷却水。
⑦丝网除沫器：
可以除去空气中绝大多数的20µ
m以上的液滴和1µ
m以上的雾滴，一般采用规格为直径0.25㎜×
40孔且高度为150㎜的不锈钢丝网。
⑧空气加热器：
采用列管换热器，空气走管程，蒸汽走管外。
⑨总过滤器：
填充物按下面顺序安装：
孔板→铁丝网→麻布→活性炭→麻布→棉花→麻布→铁丝网→孔板
介质要紧密均匀，压紧一致，上下棉花层厚度为总过滤层厚度的1/4，中间活性炭层为1/3。
无菌空气的检查
空气系统的无菌检测主要考察过滤器是否失效。
过滤器失效的检测方法之一是检测过滤器两侧的压降，压降大说明过滤介质被堵塞；
二是用粒子计数器测定空气中的粒子数是否超标，有无达到洁净度要求。
3.7发酵
以2％的接种量接种于发酵培养基，35℃培养56小时，进行液体深层发酵培养；
在发酵过程中，采取调节pH的方法控制发酵，即：
将种子接种于发酵培养基后，使发酵液初始pH为7；
在发酵期间，当发酵液酸性逐渐增加时，应控制发酵液pH不低于6.0；
随后，当发酵液碱性逐渐增加时，应控制发酵液的pH不高于8.0。
3.8分离纯化
工业中使用的基本都是碱性蛋白酶的粗制品，进一步的分离纯化有助于更好地确定酶的性质及作用机制。
以菌株的发酵液为处理对象，首先离心除去菌体细胞及其它不溶性物质，对无细胞发酵液进行沉淀，达到分离和浓缩的目的。
再通过等电层析、亲和层析等不同的色谱层析手段对碱性蛋白酶进一步纯化。
4工艺计算
4.1碱性蛋白酶发酵工艺技术指标
指标名称
单位
指标数
生产规模
t/a
3
生产方法
深层液态发酵
年生产天数
d/a
100
产品日产量
0.03
产品质量
比活力（U/g）
50万
倒罐率
%
1.0
发酵周期
h
36
发酵液酶活力
U/ml
18000
碱性蛋白酶提取率
85
冷冻干燥酶收率
80
平均总收率率
68
4.2工艺参数与基本物性数据的选取
4.2.1工艺参数
碱性蛋白酶比活力比活力为50万U/g，生产周期为36h，发酵温度为37℃，溶氧为0.03-0.04MPa。
4.2.2基本物性数据的选取
在低温下油或油脂的平均热容在2.05-2.51kJ/（kg·
℃），随着温度升高比热将增加。
4.3物料衡算
根据物料衡算的质量守衡定律，在间歇操作过程中，若系统内不发生物料量的积累，输入的物料量等于输出的物料量。
表1物料的基本物性参数
密度（kg/m3）
汽化替热
kJ/kg
比热容
kJ/（kg·
℃）
沸点（℃）
培养基
1000
4.183
水
998
2258
生产1000kg比活力为50万U/g的发酵液量：
50万U/g×
1000×
1000=108万U
108万U/18000=2.78×
107ml=27.8m3
18000U/ml–发酵液酶活
每日所需量
V0=V发/（0.68×
0.7）=0.278/（0.68×
0.7）=1.75m3
0.68—平均总收率0.7—填充系数
发酵液所需淀粉量:
1.75×
2%=0.035kg
发酵液所需麸皮量:
5%=0.0875kg
发酵液所需玉米浆量:
3%=0.0525kg
二级接种量：
V2=1%V1=0.0175m3
吐温-80（M/V）：
0.02%×
1.75=0.00035kg
MgSO4（M/V）：
发酵罐的尺寸个数：
尺寸：
2立方米个数;
1个
4.4热量衡算
4.4.1基准温度的选定
为便于计算，热量输入和输出的基准温度选为20℃（293K）。
4.4.2连消塔的热量衡算
Q=Gc（t2-t1）=13406×
3.91×
（115-70）=2.36×
106（kJ/h）
4.4.3发酵罐的热量衡算
发酵时放出的生物热：
Q总=4.18×
6000×
102.14=2.56×
5分离干燥
5.1双水相萃取
萃取原理:
将亲水性聚合物加入水中会形成两相。
聚合物以不同的比例分配与这两相中，而水分在每一相中都会占很大的比例（85%-95%），生物蛋白质等在这种体系中能够保持自然活性。
当两种聚合物的水溶液相互混合时，究竟是分层成两相，还是混合成一相，取决于两种因素，一是混合熵的变化，二是分子间的作用力。
对大分子而言，则分子间的作用力占主导地位，也就是说，由分子间的作用力决定混合的结果。
若两种聚合物的分子间存在斥力，那么再某一分子的周围就可能系同种分子而非异种分子。
当达到平衡后则分成两相，两种聚合物分别进入到每一相中，达到分离的目的。
反过来，如果两种聚合物之间存在引力，如在带相反电荷的两种聚合物电解质之间，则它们相互结合而存在于同一相中，若两种聚合物间不存在分子间力，则它们相互混合。
根据上述分析可知，能够进行双水相萃取的必要条件是：
形成的两种聚合物分子间存在引力。
双水相萃取中，影响分配的主要参数有聚合物的分子质量和浓度、pH、盐的种类和浓度、操作稳定等。
聚合物分子质量低时，生物大分子易分配于富含该聚合物的相中，当远离临界点时，双水相萃取本身受温度的影响很小。
大规模生产总是在常温下操作，一则节省制冷费用，再则聚合物在常温下对蛋白质有稳定作用，不会引起损失，同时温度高时，粘度低，有利于相的分离操作。
因此，确定适宜的操作条件，可达到较高的分配系数和选择性。
双水相萃取的一个重要优点是可直接从细胞破碎浆液中萃取蛋白质而无需将细胞碎片分离，一步操作可达到固液分离和纯化两个目的。
双水相萃取方法：
双水相萃取法的一个主要应用是胞内酶的提取，采用双水相系统可使欲提取的酶与细胞碎片以较大的分配系数分配在不
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