脓汁和粪便标本中病原菌的检测.docx
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脓汁和粪便标本中病原菌的检测
微生物实验报告
实验名称
脓汁和粪便标本中病原菌的检测
实验者
学号
日期
2016-11-25
指导老师
一、实验目的
1、掌握培养基制备的原则和一般方法。
2、掌握病原菌的分离与培养方法。
3、掌握油镜的正确使用、细菌涂片标本的制备、革兰氏染色法，熟悉细菌基本形态。
4、熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。
5、掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。
6、熟悉药物敏感性试验方法的种类、原理及应用，掌握纸片扩散法。
7、掌握玻片凝集试验的原理、方法、结果观察与判断。
2、实验器材
1、天平、称量纸、干粉培养基、锥形瓶、量筒、15支试管、试管架、试管筐、5ml刻度吸管、平皿、洗耳球、酒精灯。
2、脓汁标本1支，粪便标本1支；碘酒棉球1瓶，酒精棉球1瓶，眼科镊子2把；伊红美兰平板2个，营养琼脂平板5个。
接种环，酒精灯。
3、斜面4支，空气、手指皮肤、细菌分离培养物（上次实验平板）。
4、斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张，染色瓶，染色架。
5、斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把。
6、半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。
3、方法与步骤
流程图：
1、培养基的制备：
培养基
称量干粉培养基（g）
水量（ml）
煮沸（次）
分装（ml）
备注
营养琼脂
11.4
300
2瓶，500ml锥形瓶，平板
营养琼脂
2.9
75
3
5
15支x3，中试管，斜面
营养肉汤
1.1
50
1
3
15支x3,小试管,肉汤
半固体琼脂
1.7
60
3
4
15支x3，小试管，高层
干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸、牛皮纸，用橡皮筋扎好→放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到髙压蒸汽灭菌室→灭菌（用于倒平板的培养基不用加热溶解，摇匀即可）。
2、细菌的分离培养
1）空气的细菌学检查
每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点），将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边，平板暴露于空气中15分钟，然后平板倒扣盖上，作标记。
37℃温箱培养24小时，观察结果。
2）手指皮肤的细菌学检查
在普通平板上接种手指上的细菌。
上:
甲、丙→常规洗手，下:
乙、丁→标准洗手。
第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。
3）平板划线分离法
甲→脓汁标本（pusspecimen）→营养琼脂平板（nutrientagarplate）
乙→脓汁标本（pusspecimen）→营养琼脂平板（nutrientagarplate）
丙→粪便标本（stoolspecimen）→伊红美蓝（eosinmethyleneblueplate）
丁→粪便标本（stoolspecimen）→伊红美蓝平板（EMBplate）
方法：
（1）右手拿接种环（如握笔式），烧灼灭菌，欲伸入试管内的接种环杆部分亦要迅速通过火焰2~3次，以杀灭其表面细菌；
（2）左手握住盛有标本的试管的下端，右手以无名指、小指与手掌在火焰旁拔出试管棉塞并挟住之，将管口迅速通过火焰三次灭菌；（3）立即将已灭冷却的接种环伸入试管内，沾取标本（或菌液）一环，试管口火焰灭菌后塞好棉塞;（4）左手斜持平板，略开盖，在酒精灯火焰左前方约5~6cm处，将接种环上的菌液涂抹于平板表面的边缘部分；（5）烧灼接种环，冷却后，从原涂抹部分开始，连续平行划线，每次只划平板的1/4~1/5，划毕后接种环再经火焰灭菌，冷却后用同样方法在平板其余部分划线，每次划线要与前次划线重叠1-3条，共计3^次（区）；（6）接种完毕，将接种环烧灼灭菌后方可放下；（7）将培养皿倒置，37°C培养34小时后，观察结果。
3、细菌的纯培养
斜面接种分工
甲→普通平板→金黄色菌落（auratus，goldenyellow）→1支斜面
黄色菌落可能是空气污染的微球菌、黄色小球菌，不能挑选。
乙→普通平板→白色菌落（albus，white）→1支斜面
丙→EMB平板→紫黑色菌落（atropurpureus）→1支斜面
丁→EMB平板→粉红色菌落（pink）→1支斜面
戊→EMB平板→粉红色菌落（pink）→1支斜面
※斜面正面上2/3作标记：
组号+金黄、白色、紫黑、粉红。
→收集平板-灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。
4、细菌的形态学检查
1）革兰染色法
涂片→干燥→固定→染色
（1）涂片→干燥→固定
甲→金黄，紫黑乙→金黄，紫黑
丙→白色，粉红丁→白色，粉红
方法：
涂片：
①接种环取盐水3ulX2滴，水滴间距小于2cm;②取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混勻，涂成大于lcm2;③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。
→干燥→固定：
手持载玻片→端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2〜3秒钟。
（2）革兰染色
涂片→干燥→固定→结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95%乙醇→脱色约20秒钟—7尺洗—稀释品红—复染1分钟—水洗—吸干，镜检。
★取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。
★影响革兰染色的关键步骤是涂片和脱色。
2）半固体接种法
甲→紫黑乙→紫黑
丙→粉红丁→粉红
方法：
①接种环斜面取菌，在靠近培养基液面管壁上，上下研磨接种。
②在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。
退出接种环，烧灼灭菌。
③标记：
组号，颜色
3）肉汤接种法
甲→金黄乙→白色
丙→紫黑丁→粉红
方法：
（1）接种环斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接种；
（2）在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。
退出接种环，烧灼灭菌；（3）标记：
组号，颜色
4）油镜的使用
油镜使用方法：
10X物镜—看清标本—滴加香柏油—100X油镜—浸泡油中→模糊物象→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油—擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:
3）混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。
5、细菌的生化试验等
a.细菌的糖发酵试验
甲—紫黑菌苔—①葡萄糖乙—紫黑菌苔—②乳糖
丙→粉红菌苔→③葡萄糖丁→粉红菌苔→④乳糖
方法：
①用砂轮在糖发酵管液面上方2〜3cm处切割，然后，向切口外侧分离掰断，管口烧灼灭菌。
②接种针斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。
③退出接种针，烧灼灭菌。
④管口朝向相同，放置在平皿内。
b.抗菌素敏感性试验
纸片扩散法
甲→金黄菌液乙→白色菌液
丙→紫黑菌液丁→粉红菌液
方法：
①先取→环菌液；②沿平板直径拉一条细菌接种线；③再取一环菌液；④旋转平板90度角，拉另一条接种线，使两条细菌接种线呈“十字形”；⑤然后在平板上半部，作连续来回密集划线，每次划二分之一平板；⑥旋转平板90度角，二次密集划线；⑦旋转平板90度角，三次密集划线；⑧旋转平板90度角，四次密集划线；⑨设三点，呈等边三角距离；⑩点距离平板边缘约15mm;⑪作标记：
青、先、庆；⑫镊子尖嘴朝下，夹取相应药物纸片的边缘，平贴在已设定的位置上，轻轻按压纸片。
c.血浆凝固酶试验
兔血浆+金黄色，白色
方法：
①取二滴兔血浆（rabbitplasma）置于洁净的玻片上。
②分别用接种环取白色和黄色菌苔（约2〜3个菌落的菌量）与血浆研磨混合成直径8〜10mm的一层薄菌膜，立即观察结果。
③菌液出现明显凝块者为阳性，否则为阴性。
d.半固体穿刺接种法
甲→紫黑,乙→紫黑；
丙→粉红,丁戊→粉红。
方法：
①接种针斜面取菌，从半固体中心，垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针；②管口、接种针经火焰烧灼灭菌；③标记:
组号,颜色。
6、细菌的血清学试验、结果分析
玻片凝集试验
方法：
（1）取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。
远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul;
（2）用接种环分别取粉红色菌苔，约1～2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀。
※载玻片来回倾侧，让菌液充分混匀，凝集速度更快、结果更清楚。
※菌液凝集者记为阳性，菌液均匀混浊记为阴性。
4、结果与讨论
1、培养基的制备：
2、细菌的分离培养
1）空气的细菌学检查
结果分析:
细菌菌落直径1～3mm，有光滑型、粗糙型、黏液型。
霉菌菌落比较大，呈棉絮状、绒毛状（霉菌和酵母菌最适培养温度为25℃～28℃）。
分析讨论：
在课堂上，和其他组比较发现，微生物实验室中空气细菌是比较少的，厕所菌落多，可能是因为实验室是封闭的，且经常紫外线照射消毒，故而空气中的细菌少，厕所人流量多，空气中的细菌也就多了。
2）手指皮肤的细菌学检查
结果分析：
1.比较洗手前后细菌的（颜色）种类.
洗前细菌种类多,洗后细菌种类少。
→洗手能洗掉大多数暂住菌。
2.比较常规和标准洗手的细菌数量.
常规（简单）洗手，平板上细菌数量少。
标准洗手，平板上细菌数量多。
讨论：
常住菌数量大，牢固附着在皮肤上，常洗不掉，标准洗手可洗松动，经摩擦接种、脱落到培养基上，显示细菌更多。
3.用碘酒消毒后未发现菌落，说明碘酒消毒可以消毒彻底。
而空白对照说明我们手指皮肤上的细菌比空气中的多。
3）平板划线分离法
结果分析：
1.脓汁标本在普通平板上有金黄色、白色两种菌落，菌落的色素是脂溶性的，是细菌本身的颜色。
菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。
2.粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落色素是水溶性的，不是细菌本身的颜色，颜色的产生是因为大肠埃希菌分解乳糖产酸，酸使伊红与美蓝结合，形成紫黑色具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落，菌落直径2～3mm。
致病菌不分解乳糖，菌落呈伊红的颜色，淡粉红色，半透明，直径1～2mm。
3、细菌的纯培养
观察斜面培养物：
1.从普通平板上挑取的金黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，金黄色或白色。
2.从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。
菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明或半透明。
4、细菌的形态学检查
革兰染色法
镜下观察：
用普通平板，从脓汁标本中分离得到金黄、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。
结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。
紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。
粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。
显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。
5、细菌的生化试验等
a.细菌的糖发酵试验
糖发酵实验结果：
菌落
葡萄糖发酵
乳糖发酵
紫黑色
分解糖，产酸产气
分解糖，产酸产气
粉红色
分解糖，产酸不产气
不分解糖
b.抗菌素敏感性试验
抗菌素敏感性试验之紫黑菌液
药敏试验结果：
青霉素头孢曲松庆大霉素
金黄色+++
白色--+
紫黑-++
粉红-++
-：
耐药±：
中度敏感+：
敏感
分析：
G+球菌对青霉素和头孢曲松敏感。
G-杆菌对青霉素耐药，对头孢曲松敏感。
G+球菌和G-杆菌对广谱抗菌素庆大霉素都敏感。
c.血浆凝固酶试验
现象：
白葡很容易涂抹均匀，金葡很快凝固。
结果观察与讨论：
1、金黄色菌苔能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,附着于菌体表面,形成凝块，涂抹不开。
说明金黄色细菌为致病菌。
2、白色菌苔不发生凝块，容易涂抹。
呈均匀乳白状态。
3、来回侧倾载玻片，让菌液流动起来，结果更明显。
d.半固体穿刺接种法
现象：
半固体培养基中，紫黑色菌落菌种扩散生长，培养基呈扩散云雾混沌状态；粉红色菌落菌种沿穿刺线生长，穿刺线边缘整齐，周围培养基清澈透明。
分析讨论：
半固体动力试验表明紫黑色菌落菌种半固体动力试验结果阳性，有鞭毛；粉红色菌落菌种半固体动力试验结果阴性，无鞭毛。
6、细菌的血清学试验、结果分析
玻片凝集试验
由实验结果图可看到，生理盐水一端不出现凝集，福氏志贺菌诊断血清一端菌液浑浊，少量絮状，为阳性。
说明粉红菌为福氏志贺菌。
7、结论：
对照常见肠道感染细菌主要生化反应特征，血清学分析，说明黄色菌落是金黄色葡萄球菌；白色菌落是白色葡萄球菌；紫黑色菌落是大肠埃希菌；粉红色菌落是福氏志贺菌。
8、总结：
1）分析：
制备好培养基后，首先采用平板划线分离法，从不同的样本中分离出不同的细菌。
从脓汁标本中分离出黄色和白色两种菌落，在显微镜下观察，这两种细菌均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌；结合菌落的颜色，可以初步断定，这是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
再通过血浆凝固酶试验，观察到金黄色葡萄球菌能使血浆产生颗粒性物质，而白色葡萄球菌则没有任何反应，说明了金黄色葡萄球菌是致病菌。
最后通过药敏试验，可见不同的抗生素所形成的抑菌圈不同，其中金黄色葡萄球菌对青霉素最敏感，而紫黑和粉红细菌对青霉素耐药。
用伊红美蓝平板分离菌落时，可以从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽的菌落和粉红色半透明菌落；在显微镜下观察时，这两种菌均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌；经糖发酵试验，可以观察到，紫黑色的细菌使能使葡萄糖和乳糖的试管变色和产生气体，粉红色的细菌只能使葡萄糖的试管变色而无气体，对乳糖无反应；经半固体动力试验，观察到紫黑色的细菌使半固体培养基成浑浊状态，粉红色的细菌只在接种针插入的方向聚集。
综上所述，紫黑色的细菌为大肠埃希菌，粉红色的为福氏志贺菌。
2）实验的不足之处：
1.我们的实验在操作上也产生了许多错误和不足：
2.无菌操作的意识不够强，可能会导致杂菌感染而使实验数据不准确。
3.革兰染色时涂片过厚，导致脱色不完全造成假阳性。
4.平板划线太重且接种环持握过直导致划线过深。
5.半固体接种穿刺过浅，实验现象不明显。
3）注意事项：
1.在培养基配制好后，我们需要检查培养基是否合格。
检查培养基是否合格的方法：
①无菌试验：
将待检培养基置于35～37℃培养箱培养24小时，无任何细菌生长为合格。
②效果试验：
将已知的标准参考菌株，接种于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。
2.玻璃器材洗干净的标准：
①洗涤时观察:
洗后的玻璃器材附着在内壁上的水不是个别水珠,而是一层极薄的水膜。
②干燥后观察:
对着光亮处观看玻璃器材,非常透明,内外壁上不出现大片发白或白点,也无微小污点和粉末。
3.接种环使用前后必须灼烧灭菌：
接种环使用前，长期暴露于空气中，会带有许多空气中的杂菌，不灼烧灭菌则会导致实验过程中杂菌污染。
接种环使用后，带有实验中的相关细菌，若不及时灼烧灭菌会导致前一菌种对后一菌种造成污染,且实验细菌接触外界，污染实验室内的相关物品，同学们接触后很可能带来疾病的危险。
4.平板储存待用或做细菌培养时，需要倒置:
防止平板水分蒸发丢失；防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成；冷凝水中可能含有杂菌，如果滴入平板表面，会影响实验结果。
5.用革兰氏染色法染色过程中要严格控制四种染料染色的时间（大约一分钟），其中涂片与脱色是关键步骤，如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性，如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性。
流水冲洗时注意水流大小与速度适宜均勻。
6.应在发酵管液面上方大约2～3cm处切割，否则，可能产气可经管口漏出而导致无法判断是否产气。
实验完成后，管口不能朝上，这是因为管口朝上时，反应过程中产生的气体会溢出，观察不到正确的实验结果，最终会影响细菌的最终鉴定。
7.半固体穿刺时未完全沿原路返回，可能在判断动力阳性时造成一定干扰。
8.菌落生化反应必须要求纯的细菌，否者很可能造成结果不可分析。
所以需要保证培养基合格并且培养菌落不受外来细菌污染。
9.实验时应坐稳，很专注，不分心，在火焰周围10～20厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话，以免感染病原菌。
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