天祝白耗牛Cs易位与纯白毛色的关联分析Word格式.docx
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1.4Cs与白牦牛的关系7
第二章材料方法积及实验结果8
2.1实验材料与方法8
2.1.1实验材料8
2.1.1.1实验动物来源及样品采集8
2.1.1.2试验主要试剂9
2.1.1.3主要仪器设备9
2.1.1.4主要试剂和溶液的配制9
2.1.2实验方法9
2.1.2.1天祝白牦牛血样基因组DNA的提取9
2.1.2.2基因组DNA的质量检测及稀释9
2.1.2.3特异性引物的合成9
2.1.2.4PCR扩增10
2.1.2.5PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测11
2.1.2.6PCR产物的测序及其分析11
2.2结果与分析12
2.2.1天祝白牦牛基因组DNA样品质量的检测12
2.2.2融合点扩增结果及分析12
2.2.3PCR产物的测序结果14
第三章讨论15
参考文献16
附录17
致谢19
天祝白牦牛Cs易位与纯白毛色的关联分析
本科生：
李晓芳指导教师：
雷初朝教授
（西北农林科技大学动物科技学院杨凌陕西712100）
摘要：
Cs是Coloursidedness的缩写，即白色背线性状，在普通牛中属于显性遗传性状。
该性状表现为色素在身体两侧、鼻尖和两耳尖等部极化分布，在牛上外观表现为从头颈部至臀尾部为白色背线，也称为“lineback”或“witrik”（表示白背性状）。
Durkinetal.（2012）的研究报道称普通牛（9个品种）和牦牛的背线性状都是由6号染色体上的KIT基因与29号染色体的系列易位造成的。
Durkinetal.（2012）的研究发现Cs易位产生五个融合位点，并针对五个融合位点设计合成了五对特异性引物。
本研究以天祝白牦牛为实验对象，利用已知的这五对特异性引物扩增天祝白牦牛基因组DNA的五个融合位点，以PCR扩增和基因测序为主要研究方法，根据天祝白牦牛基因组DNA的五个融合位点的扩增结果及PCR产物的测序结果，揭示Cs易位与天祝白牦牛纯白毛色的关系，即进行天祝白牦牛Cs易位与纯白毛色的关联性分析。
通过实验，本研究主要获得以下结论：
（1）天祝白牦牛中的纯黑个体不存在Cs的易位；
（2）天祝白牦牛中的纯白和（或）白有斑个体一定存在Cs6易位，部分纯白和（或）白有斑个体同时存在Cs6和Cs29易位，没有只存在Cs29易位的个体。
以上结果说明，Cs易位是造成天祝白牦牛纯白毛色的原因之一，但两者之间的具体的关系还有待进一步研究。
关键词：
天祝白牦牛；
纯白毛色；
Cs易位；
融合位点
Thetranslocationofcoloursidedness（Cs）anditsassociationwithsolidwhitecoatcolourinTianzhuyak
Author：
LiXiaofangSupervisor：
Prof.Dr.LeiChuzhao
（CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&
FUniversity,Yangling,Shanxi,712100,P.R.China）
ABSTRACT:
CsistheabbreviationofColoursidedness.Coloursidednessisadominantlyinheritedphenotypeofcattlecharacterizedbythepolarizationofpigmentedsectorsontheflanks,snoutandeartips.Itisalsoreferredtoas‘lineback’or‘witrik’（whichmeanswhiteback）,ascolour-sidedanimalstypicallydisplayawhitebandalongtheirspine.Durkinetal.（2012）reportedtheserialtranslocationofKITfromchromosome6tochromosome29（Cs29allele）andrepartitiontochromosome6（Cs6allele）wereresponsibleforthecolorsidednessofbothdomesticcattle（ninebreeds）andyaks.Durkinetal.（2012）revealedthattheCstranslocationproductsfivefusionpoints,anddesignedandsyntheticedfivespecificprimersetswhichbasedonthefivefusionpoints,respectively.OurstudywasconductedonTianzhuyak,thePCRamplificationandsequencingasourmajormeans.Byanalyzingthedates,werevealedtheassociationbetweentheCstranslocationandthesolidwhitecoatcolourofTianzhuyak.Theresultswereshowedasfollows:
（1）ThesolidblackindividualsdonothavetheCstranslocation;
（2）Thesolidwhiteindividualsand（or）thewhitespottedanimalshaveeithertheCs6orCs29,orboth.Accordingtotheresults,theCstranslocationisoneofthereasonsthatcausesthecoatcolourvariationinyak.However,furtherstudyisneededtoidentifycertainrelationshipbetweenthem.
KEYWORDS:
Tianzhuyak,solidwhitecoatcolour,Cstranslocation,fusionpoint.
第一章文献综述
牦牛（Bosgrunniens）是海拔3000m以上的青藏高原地区特有的家畜之一，在青海、甘肃、新疆、云南、四川等地均有分布[11]。
牦牛对高寒草地生态环境条件具有极强的适应性，还能够充分利用一般的其他家畜不能利用的高寒地区的草场，牦牛是一种极少会与人类争夺粮食、生存空间和自然资源的原始的家畜品种，是当地牧民和畜牧业经济不可缺少的家养动物。
牦牛除作役用外，还能提供肉、乳、皮、毛等畜产品。
其中，作为特种动物毛，耗牛毛（包括尾毛、毛绒）产量大，质量好，除供应国内需求外，是我国出口畅销的畜产品之一，并以白耗牛毛最为驰名。
全世界现有牦牛1760多万头，我国的牦牛总数达1656万余头，约占世界牦牛总数的95%，共分为12个牦牛品种或类群，是世界上拥有牦牛数量和品种最多的国家。
1.1毛色的形成机理
哺乳动物的毛色是由黑色素细胞的一个特殊的细胞器黑素体合成的黑色素决定的，有两种黑色素，黑色或棕色的真黑素和红色或黄色伪黑素，真黑素和伪黑素的数量和比例决定了哺乳动物皮肤、毛发和眼睛的颜色。
不同种属的哺乳动物的毛色是由许多与毛色变异相关的基因决定的，不仅这些基因的突变会对毛色的形成产生重要影响，而且通过这些基因间的互作来控制毛色的产生。
与毛色形成相关的基因主要有以下这些：
MC1R、KIT、TYRP和ASIP等，根据这些基因的作用机制可将它们分为两类：
一类是使黑色素细胞的种类发生差异或者是在黑色素细胞的生成、增殖和迁移过程中起作用；
第二类是它们直接作用于皮肤色素的合成过程。
因而，对造成不同的肤色和毛色的原因，我们可以理解为是由于基因的调节作用，进而改变了黑色素细胞或者色素的合成过程（或者是二者的共同作用）而导致的。
1.2Cs性状及其研究进展
1.2.1Cs性状
白背性状早在中世纪时期就有文字记载，近年在全世界各奶牛品种中分离了几个品种，包括比利时蓝牛和瑞士褐牛等品种。
1.2.2Cs研究进展
据有关研究报道，对部分牦牛品种的MC1R基因的编码区域的序列测定进行了一些实验，但是并没有发现MC1R的基因型与牦牛黑色毛色或白色毛色表型的联系。
尽管牦牛毛色的遗传基础很少被研究，但是以前在普通牛上的研究和普通牛和牦牛的杂交记录中强调了几个可能的牦牛的毛色变异的机制。
对普通牛的毛色的遗传学基础回顾发现牦牛的棕色毛色至少有三个候选基因：
MC1R，是牛的E位点，调控真黑素和伪黑素色素合成的开关，他的无效突变（等位基因由于片段的缺失、插入以及重排等原因使其编码的蛋白质失去功能的突变。
既可以是导致无法合成蛋白质的突变，也可以是促进合成无功能蛋白质的突变）是导致挪威牛、荷斯坦牛、高原牛和加洛韦牛的浅红色毛色的原因；
TYR参与真黑素的合成通路，被认为与德克斯特牛的深棕色毛色有关；
PMEL是黑素体发育必不可少的基因，通过与MC1R的基因互作作用决定着高原牛的黑色、深褐色、银灰色、白色或乳白色、红色和黄色毛色。
普通牛的显性遗传性状背线是由来自29号和6号染色体的KIT基因的一系列易位的两个等位基因所决定的。
白斑普通牛和牦牛的所有相似点暗示驯化牦牛的斑点表型与KIT基因的突变和易位相关。
有趣地是，Durkinetal还发现在背线性状的牦牛中同时有两个KIT基因易位的等位基因（Cs6和Cs29），这很可能是由与普通牛的杂交而导致的基因渗入，有待通过更多大样来确认。
白背性状是由29号染色体上的第一个等位基因决定的（Cs29），它是由6号染色体上的一段包含KIT基因的492Kb的片段易位到29号染色体上，然后6号染色体上的第二个等位基因（Cs6）来源6号染色体的融合的一段575kb的片段的返回和29号染色体KIT基因位点的序列。
我们还得知这两个易位都有环形穿梭中间体的参与。
据我们所知，一个由新的拷贝数变异产生机制导致的同源染色体上但非同线的等位基因决定的性状，这是第一例。
Durkinetal.（2012）已经证实，KIT基因易位的等位基因Cs（Cs6和Cs29）来源于普通牛，通过种间杂交而引入到牦牛群中。
ZhangMengqietal.（2013）的研究证明了Cs6和Cs29不仅造成背线性状，还负责驯化牦牛的白色表型，进一步证明牦牛中背线性状来源于与普通牛的杂交。
1.3白牦牛的毛色及品种的形成
1.3.1白牦牛毛色
家畜的毛色表型种类复杂、多样，是品种鉴定的重要特征之一。
生产实践中，可以根据毛色判定个体是否属于纯种[9]，此外毛色与部分生产性能有一定的相关性[19]。
对于产毛性家畜来说，毛色是其主要的经济性状和表型性状，毛色的遗传具有很明显的多样性特性，可以作为识别个体和品种归属等信息的遗传性标记。
但是毛色的遗传基础很复杂，在同一个基因座位上的不同等位基因，它的显隐性关系因品种不同而不同，多个基因座位之间又存在复杂的相互作用，因而它们的杂种后代往往呈现出多种毛色类型，因而各种毛色的分离比例并不是完全的符号孟德尔分离与组合定律[6]。
哺乳动物毛色的多样性主要由黑色素细胞中真黑色素和伪黑色素的数量和比例的不同而形成的。
与毛色相关的基因主要有MC1R、ASIP、TYRP和KIT等，KIT基因编码肥大细胞生长因子受体，其在特定的细胞（成黑色素细胞和黑色素细胞）中表达，对黑色素细胞的形成、成熟及增殖迁移有重要作用[4]。
KIT位点控制黑色素细胞形成，相对于其它位点具有显性上位作用。
KIT基因编码“肥大/干细胞生长因子受体”，它能够表达黑色素细胞前体物，KIT基因发生突变，它的突变可能影响黑色素细胞的增殖、迁移和存活[21]。
在牦牛中，毛色性状对产乳和产肉性能虽然没有直接的影响，但是对牦牛毛绒的工艺特性具有重要的作用。
耗牛毛、绒制品深受消费者的喜爱，天祝耗牛被毛纯白，可染性强，无髓毛含量高达75%以上，绒纤维细、强力大、光泽好、富有弹性，可纺性强[10]，具有极高的经济价值和社会效应。
1.3.2品种的形成
天祝白牦牛是我国珍稀的地方牦牛品种，是经过长期自然选育和人工选育而成的特有畜种。
它不仅是甘肃省宝贵的畜种资源，也是我国乃至世界珍稀的牦牛种质资源，享有草原“白珍珠”、祁连“雪牡丹”之美称，已被列入国家级畜禽保护品种[13]。
由于天祝白牦牛遗传性能稳定，毛色纯白，其毛绒具有较高的利用价值。
天祝牧区的藏族人民历代饲牧牦牛，据牧民介绍，100多年前，在天祝马雅雪山草原上就有白色的牦牛个体饲牧。
在我国明朝时期的藏传佛经中就有有关白色被毛的牦牛的记载。
由于在当时天祝白牦牛不仅是给朝庭的贡品，而且天祝白牦牛的毛绒能染成其他颜色，故其经济价值高，促使当地牧民历来就注重繁育白牦牛[13]。
新中国成立后，党和政府非常重视畜牧业的生产和发展，积极开展白牦牛的选种选育工作，使白牦牛的饲养数量迅速增加，牦牛质量得到了显著的提高。
尤其是在改革开放以来，还专门成立了天祝白牦牛的保种选育领导小组和天祝白牦牛育种实验场，专门从事白牦牛的保种选育工作，并确定了“肉毛兼用”的选育方向，制定了选育计划、《天祝白牦牛评级试行标准》及种质资源保护实施方案，建立了选育区和育种核心群，使天祝白牦牛品种资源的保护及开发利用得以科学有序地进行。
可以说，天祝白牦牛是在原有少量白牦牛的基础上，经产区劳动人民，不断选育而发展起来的[13]。
1.4Cs与白牦牛的关系
Durkinetal.（2012）的研究报道称普通牛（9个品种）和牦牛的背线性状都是由6号染色体上的KIT基因与29号染色体的系列易位，然后再重新易位到6号染色体上造成[1]。
6号染色体上KIT基因的重复和29号染色体上KIT基因的异常插入是造成比利时蓝牛和其他牛品种白背性状的原因。
6号染色体上已重复的KIT基因的第二次插入是导致瑞士褐牛白背性状的原因。
Brenigetal.（2013）证实了，WhiteGalloway和WhitePark的有斑、多斑和无斑这种毛色变异是由6号染色体上一个KIT基因的重复（Cs6）和29号染色体上的一个异常插入（Cs29）而造成的，正如最近在白背比利时兰牛中描述得那样。
WhiteGallowayandWhitePark存在等位基因Cs29，并且Cs29存在剂量效应，在WhiteGallowayandWhitePark中杂合子个体（Wt29/Cs29）表现为在白色的身体上有更大的色素斑点，而纯合子个体（Cs29/Cs29）的白色身体上没有色素斑点。
ZhangMengQietal.（2013）的研究证实了，驯化牦牛的背线性状是由Cs6和Cs29负责的，还提出了Cs6和Cs29对全白牦牛的可能影响。
具有背线性状的牦牛是携带一种Cs等位基因还是两者都有携带观察不到明显的区别，这表明Cs6和Cs29对色素沉着具有相同的效应，没有当两者共存的时的附加效应。
目前的PCR实验还不能区分纯合子和杂合子的等位基因Cs6的情况（Durkinetal.2012），所以研究的全白个体的准确基因型还是未知的。
然而，白色牦牛间的杂交总是能够产生全白的后代，天祝白牦牛一直是白色被毛，这暗示在突变位点是纯合的（ZhangMengQietal.2013）。
ZhangMengQietal.（2013）研究最后得出的观点是，杂合的Cs6和（或）Cs29可能导致背线性状，但是纯合的Cs6和（或）Cs29造成了驯化牦牛的全白表型。
第二章材料方法积及实验结果
2.1实验材料与方法
2.1.1实验材料
2.1.1.1实验动物来源及样品采集
本实验共用了31份天祝白牦牛血样，其中纯白毛色的15头，白有斑的12头，纯黑4头，这些血样的详细信息见表2-1.
表2-1所采集的34头天祝白牦牛的详细信息
品种
Breeds
样本数
Samplesize
毛色
CoatColour
天祝白牦牛
15
纯白
4
纯黑
12
白有斑
2.1.1.2试验主要试剂
普通试剂：
琼脂糖，无水乙醇，溴化乙锭（EB），溴酚蓝，Tris，硼酸，乙二胺四乙酸二钠（EDTA），70%乙醇，氯仿，。
分子生物学试剂：
TaqDNA聚合酶（在天根生物公司购买），5倍的mixreationbuffer（在天根生物公司购买），DNAmarker（DM2000，在天根生物公司购买），蛋白酶K。
2.1.1.3主要仪器设备
台式低温高速离心机，凝胶成像系统，PCR扩增仪，小型台式离心机，超低温冰箱，恒压恒流电泳仪，琼脂糖水平电泳槽，微量移液器，天平，微波炉，分光光度计，电热恒温鼓风干燥箱，圆周振荡器。
2.1.1.4主要试剂和溶液的配制
实验所用所有试剂需用去离子高压灭菌超纯水配制。
1%琼脂糖：
0.2克琼脂糖，20ml0.5倍的TBE，用微波炉加热溶解；
10倍的TBE：
108克Tris碱，55克硼酸，9.3克EDTA溶于1000ml去离子水中；
0.5倍的TBE：
100ml10倍的TBE用1000ml去离子水稀释；
溴化乙锭（10mg/ml）：
将8µ
LEB加入到100mL0.5倍的TBE缓冲液中，完全溶解，置于棕色瓶中，用铝箔包裹于4℃保存。
2.1.2实验方法
2.1.2.1天祝白牦牛血样基因组DNA的提取
所采得的天祝白牦牛血样的基因组DNA提取方法步骤详见附录1.
2.1.2.2基因组DNA的质量检测及稀释
用琼脂糖凝胶电泳方法检测DNA品质。
电泳条带的亮度应该与Marker的亮度相当，条带明亮整齐不出现拖尾。
如果出现抹带现象，说明DNA已经出现降解，那么需要重新提取基因组DNA。
DNA在波长为260nm时的吸光光度值最大，有最大的吸收峰，蛋白质的最大吸收波长为280nm，在280nm处有最大吸收峰。
用紫外分光光度计测定所有DNA样品的浓度和纯度，测定其OD260/OD280的值，根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度，DNA纯品的OD260/OD280为1.8左右。
当比值高于1.9说明含有RNA，需进行去RNA的纯化；
比值低于1.6说明有蛋白质杂质，需进行去蛋白质纯化。
根据测到的样品浓度统一稀释到100ng/μl。
2.1.2.3特异性引物的合成
根据Durkinetal.（2012）研究发表的五个融合位点的各自的五对特异性引物序列，让上海生工生物有限责任公司合成所有的引物。
各对引物的详细信息见表2-2。
表2-2牦牛毛色Cs融合点检测引物
Primer名称
引物序列（5'
to3'
）
Length（bp）
Tm（℃）
α-DF
GGGGAGAATCTGTTTTCCTG
417
58
α-DR
GGAAGGCCTTATTGCACACT
A-EF
GAAGCAACCCAGAGATGAGC
318
59
A-ER
AAGGGAAGCCCATATGATGA
γ-BF
GCTGCAGAAAATGTTATTCCA
525
56.5
γ-BR
TCTTGAAGGGCCATAGCATC
α-βF
394
58.5
α-βR
TAAAGTCGCCAGTGCAAGTG
C-βR
CAATTGACCCCTCATTTTGG
606
55.8
C-βF
TCAACGAGGGACAACATGAA
2.1.2.4PCR扩增
（1）引物的稀释
将盛有引物粉的离心管12000rpm离心2分钟，慢慢打开管盖，按引物合成报告单上的数据加入灭菌双蒸水，稀释到10pmol/uL，4℃过夜，保存待用[22]。
（2）PCR扩增
影响PCR反应的因素较多，主要有退火温度，Mg2+浓度，引物的质量和浓度，模板DNA的质量，dNTP的的质量和浓度，循环次数和时间，延伸时间以及TaqDNA聚合酶的使用量等。
其中最主要的因素是退火温度和Mg2+浓度。
要有好的扩增效果，首先要建立最佳的PCR反应条件，使扩增片断达到一定浓度且特异性要强[22]。
PCR扩增体系（10μL）见表2-3：
表2-3PCR扩增反应体系（10μL）
组成成分
体积
DNA模板
1.0μL
正向引物
0.3μL
反向引物
Taq酶
0.2μL
2XTaqbuffer
5.0μL
dNTPmix
0.8μL
ddH2O
2.4μL
普通PCR反应程序：
94℃预变性4分钟
35cycles
94℃变性30秒
退火温度30秒
72℃延伸30-60秒
72℃终延伸10分钟
4℃保存Forever
降落PCR反应程序（α-D和A-E）：
60℃30秒
72℃30秒
94℃30秒
25cycles
55℃30秒
根据不同引物选择不同的退火温度，如表2-2所述。
2.1.2.5PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
（1）琼脂糖凝胶制备：
称取0.4g琼脂糖，加入到盛有40mL0.5×
TBE的烧杯中，将烧杯放入微波炉加热，直至琼脂糖颗粒全部融化使溶液变得清澈透亮，冷却至适宜温度（用手背皮肤衡量），用微量移液器加入EB，摇匀后慢慢倒入制胶板中，如有气泡产生用针头刺破，放好梳子，室温自然凝固后，小心将梳子取出，将凝胶放入电泳槽中，电泳缓冲液液面应高出凝胶表面约1mm。
（2）加样：
将待检PCR产物和加样缓冲液混合均匀，用微量移液器加入点样孔，同时每块凝胶上都应点一个DNAmaker（DM2000）。
点
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