干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则样本文档格式.docx

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重要疾病类型涉及骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反映（GVHD）、脊髓损伤及退行性神经系统疾病和糖尿病等。

其中许多干细胞类型，是从骨髓、脂肪组织、脐带血、脐带或胎盘组织来源间充质干细胞，它们具备一定多向分化潜能及抗炎和免疫调控能力等。

　　用于干细胞治疗细胞制备技术和治疗方案，具备多样性、复杂性和特殊性。

但作为一种新型生物治疗产品，所有干细胞制剂都可遵循一种共同研发过程，即从干细胞制剂制备、体外实验、体内动物实验，到植入人体临床研究及临床治疗过程。

整个过程每一阶段，都须对所使用干细胞制剂在细胞质量、安全性和生物学效应方面进行有关研究和质量控制。

　　本指引原则提出了合用于各类也许应用到临床干细胞（除已有规定造血干细胞移植外）在制备和临床前研究阶段基本原则。

每个详细干细胞制剂制备和使用过程，必要有严格原则操作程序并按其执行，以保证干细胞制剂质量可控性以及治疗安全性和有效性。

每一研究项目所涉及详细干细胞制剂，应依照本指引原则对不同阶段基本规定，结合各自干细胞制剂及适应证特殊性，准备并实行有关干细胞临床前研究。

　　二.干细胞制剂质量控制

　　1.对干细胞供者规定

　　每一干细胞制剂都须具备涉及供者信息在内、明确细胞制备及生物学性状信息。

作为细胞制备信息中重要内容之一，需提供干细胞获取方式和途径以及有关临床资料，涉及供者普通信息、既往病史、家族史等。

既往史和家族史要对遗传病（单基因和多基因疾病,涉及心血管疾病和肿瘤等）有关信息进行详细采集。

对用于异体干细胞临床研究供者，必要通过检查筛选证明无人源特定病毒（涉及HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等）感染，无梅毒螺旋体感染。

必要时需要收集供者ABO血型、HLA-I类和II类分型资料，以备追溯性查询。

如使用体外授精术产生多余胚胎作为建立人类胚胎干细胞系重要来源，须能追溯配子供体，并接受筛选和检测。

不得使用既往史中患有严重传染性疾病和家族史中有明确遗传性疾病供者作为异体干细胞来源。

　　自体来源干细胞供者，依照干细胞制剂特性、来源组织或器官，以及临床适应证，可对供体质量规定和筛查原则及项目进行调节。

　　2.干细胞采集、分离及干细胞（系）建立阶段质量控制基本规定

　　应制定干细胞采集、分离和干细胞（系）建立原则操作及管理程序，并在符合《药物生产质量管理规范》（GMP）规定基本上严格执行。

原则操作程序应涉及操作人员培训；

材料、仪器、设备使用和管理；

干细胞采集、分离、纯化、扩增和细胞（系）建立；

细胞保存、运送及有关保障办法，以及清洁环境原则及常规维护和检测等。

　　为尽量减少不同批次细胞在研究过程中变异性，研究者在干细胞制剂制备阶段应对来源丰富同一批特定代次细胞建立多级细胞库，如主细胞库（MasterCellBank）和工作细胞库（WorkingCellBank）。

细胞库中细胞基本质量规定，是需有明确细胞鉴别特性，无外源微生物污染。

　　在干细胞采集、分离及干细胞（系）建立阶段，应当对自体来源、未经体外复杂操作干细胞，进行细胞鉴别、成活率及生长活性、外源致病微生物，以及基本干细胞特性检测。

而对异体来源干细胞，或通过复杂体外培养和操作后自体来源干细胞，以及直接用于临床前及临床研究细胞库（如工作库）中细胞，除进行上述检测外，还应当进行全面内外源致病微生物、详细干细胞特性检测，以及细胞纯度分析。

干细胞特性涉及特定细胞表面标志物群、表达产物和分化潜能等。

　　1.培养基

　　干细胞制剂制备所用培养基成分应有足够纯度并符合无菌、无致病微生物及内毒素质量原则,残留培养基对受者应无不良影响；

在满足干细胞正常生长状况下，不影响干细胞生物学活性，即干细胞“干性”及分化能力。

在干细胞制剂制备过程中，应尽量避免使用抗生素。

　　若使用商业来源培养基，应当选取有资质生产商并由其提供培养基构成成分及有关质量合格证明。

必要时，应对每批培养基进行质量检查。

　　除特殊状况外，应尽量避免在干细胞培养过程中使用人源或动物源性血清，不得使用同种异体人血清或血浆。

如必要使用动物血清，应保证其无特定动物源性病毒污染。

禁止使用海绵体状脑病流行区来源牛血清。

　　若培养基中具有人血液成分，如白蛋白、转铁蛋白和各种细胞因子等，应明确其来源、批号、质量检定合格报告，并尽量采用国家已批准可临床应用产品。

　　2.滋养层细胞

　　用于体外培养和建立胚胎干细胞及iPS细胞人源或动物源滋养层细胞，需依照外源性细胞在人体中使用所存在有关风险因素，对细胞来源供体、细胞建立过程引入外源致病微生物风险等进行有关检查和质量控制。

建议建立滋养层细胞细胞库，并按细胞库检查规定进行全面检查，特别是对人源或动物源特异病毒检查。

　　3.干细胞制剂制备工艺

　　应制定干细胞制剂制备工艺原则操作流程及每一过程原则操作程序（SOP）并定期审核和修订；

干细胞制剂制备工艺涉及干细胞采集、分离、纯化、扩增和传代，干细胞（系）建立、向功能性细胞定向分化，培养基、辅料和包材选取原则及使用，细胞冻存、复苏、分装和标记，以及残存物去除等。

从整个制剂制备过程到输入（或植入）到受试者体内全过程，需要追踪观测并详细记录。

对不合格并需要丢弃干细胞制剂，需对丢弃过程进行规范管理和记录。

对于剩余干细胞制剂必要进行合法和符合伦理规定解决，涉及制定有关SOP并严格执行。

干细胞制剂有关资料需建档并长期保存。

　　应对制剂制备全过程，涉及细胞收获、传代、操作、分装等，进行全面工艺研究和验证，制定适当工艺参数和质量原则，保证对每一过程有效控制。

　　1.干细胞制剂质量检查基本规定

　　为保证干细胞治疗安全性和有效性，每批干细胞制剂均须符合既有干细胞知识和技术条件下全面质量规定。

制剂检查内容，须在本指引原则基本上，参照国内外关于细胞基质和干细胞制剂质量控制指引原则，进行全面细胞质量、安全性和有效性检查。

同步，依照细胞来源及特点、体外解决限度和临床适应证等不同状况，对所需检查内容做必要调节。

此外，随着对干细胞知识和技术结识不断增长，细胞检查内容也应随之不断更新。

　　针对不同类型干细胞制剂，依照对输入或植入人体前诱导分化需求，须对未分化细胞和终末分化细胞分别进行必要检查。

对胚胎干细胞和iPS细胞制剂制备过程中所使用滋养细胞，依照其细胞来源，也需进行针对有关风险因素质量控制和检查。

　　为保证制剂质量及其可控性,干细胞制剂检查可分为质量检查和放行检查。

质量检查是为保证干细胞经特定体外解决后安全性、有效性和质量可控性而进行较全面质量检查。

放行检查是在完毕质量检查基本上，对每一类型每一批次干细胞制剂，在临床应用前所应进行相对迅速和简化细胞检查。

　　为保证制剂工艺和质量稳定性，须对多批次干细胞制剂进行质量检查；

在制备工艺、场地或规模等发生变化时，需重新对多批次干细胞制剂进行质量检查。

制剂批次是指由同一供体、同一组织来源、同一时间、使用同一工艺采集和分离或建立干细胞。

对胚胎干细胞或iPS细胞制剂，应当视一次诱导分化所获得可供移植细胞为同一批次制剂。

对需要由各种供体混合使用干细胞制剂，混合前应视每一独立供体或组织来源在相似时间采集细胞为同一批次细胞。

　　对于由不同供体或组织来源、需要混合使用干细胞制剂，需对所有独立来源细胞质量进行检查，以尽量避免混合细胞制剂也许具备危险因素。

　　2.细胞检查

　　2.1质量检查

（1）细胞鉴别

　　应当通过细胞形态、遗传学、代谢酶亚型谱分析、表面标志物及特定基因表达产物等检测，对不同供体及不同类型干细胞进行综合细胞鉴别。

（2）存活率及生长活性

采用不同细胞生物学活性检测办法，如活细胞计数、细胞倍增时间、细胞周期、克隆形成率、端粒酶活性等，判断细胞活性及生长状况。

　　（3）纯度和均一性

　　通过检测细胞表面标志物、遗传多态性及特定生物学活性等，对制剂进行细胞纯度或均一性检测。

对胚胎干细胞及iPS细胞植入人体前终末诱导分化产物，必要进行细胞纯度和/或分化均一性检测。

　　对于需要混合使用干细胞制剂，需对各独立细胞来源之间细胞表面标志物、细胞活性、纯度和生物学活性均一性进行检查和控制。

　　（4）无菌实验和支原体检测

　　应根据现行版《中华人民共和国药典》中生物制品无菌实验和支原体检测规程，对细菌、真菌及支原体污染进行检测。

　　（5）细胞内外源致病因子检测

　　应结合体内和体外办法，依照每一细胞制剂特性进行人源及动物源性特定致病因子检测。

如使用过牛血清，须进行牛源特定病毒检测；

如使用胰酶等猪源材料，应至少检测猪源细小病毒；

如胚胎干细胞和iPS细胞在制备过程中使用动物源性滋养细胞，需进行细胞来源有关特定动物源性病毒全面检测。

此外还应检测逆转录病毒。

　　（6）内毒素检测

　　应根据现行版《中华人民共和国药典》中内毒素检测规程，对内毒素进行检测。

　　（7）异常免疫学反映

　　检测异体来源干细胞制剂对人总淋巴细胞增殖和对不同淋巴细胞亚群增殖能力影响，或对有关细胞因子分泌影响，以检测干细胞制剂也许引起异常免疫反映。

　　（8）致瘤性

　　对于异体来源干细胞制剂或经体外复杂操作自体干细胞制剂，须通过免疫缺陷动物体内致瘤实验，检查细胞致瘤性。

　　（9）生物学效力实验

　　可通过检测干细胞分化潜能、诱导分化细胞构造和生理功能、对免疫细胞调节能力、分泌特定细胞因子、表达特定基因和蛋白等功能，判断干细胞制剂与治疗有关生物学有效性。

　　对间充质干细胞，无论何种来源，应进行体外各种类型细胞（如成脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞等）分化能力检测，以判断其细胞分化多能性（Multipotency）。

对未分化胚胎干细胞和iPS细胞，须通过体外拟胚胎体形成能力，或在SCID鼠体内形成畸胎瘤能力，检测其细胞分化多能性（Pluripotency）。

除此以外，作为特定生物学效应实验，应进行与其治疗适应证有关生物学效应检查。

　　（10）培养基及其她添加成分残存量检测

　　应对制剂制备过程中残存、影响干细胞制剂质量和安全性成分，如牛血清蛋白、抗生素、细胞因子等进行检测。

　　2.2放行检查

　　项目申请者应依照上述质量检查各项目中所明确检查内容及原则，针对每一类型干细胞制剂特性，制定放行检查项目及原则。

放行检查项目应能在相对短时间内，反映细胞制剂质量及安全信息。

　　3.干细胞制剂质量复核

　　由专业细胞检查机构/实验室进行干细胞制剂质量复核检查，并出具检查报告。

　　在满足上述干细胞制剂质量检查规定基本上，建议在临床前和临床研究各阶段，运用不同体外实验办法对干细胞制剂进行全面安全性、有效性及稳定性研究。

　　1.干细胞制剂质量及特性研究

　　1.1生长活性和状态

　　生长因子依赖性检测：

在培养生长因子依赖性干细胞时，需对细胞生长行为进行持续检测，以判断不同代次细胞对生长因子依赖性。

若细胞在传代过程中，特别是在接近高代次时，失去对生长因子依赖，则不能再继续将其视为合格干细胞而继续培养和使用。

　　1.2致瘤性和促瘤性

　　由于大多数间充质干细胞制剂具备相对弱致瘤性，建议在动物致瘤性实验中，针对不同类型干细胞，选取必要数量细胞和必要长观测期。

　　在动物致瘤性实验不能有效判断致瘤性时，建议检测与致瘤性有关生物学性状变化，如细胞对生长因子依赖性变化、基因组稳定性变化、与致瘤性密切有关蛋白（如癌变信号通路中核心调控蛋白）表达水平或活性变化、对凋亡诱导敏感性变化等，以此来间接判断干细胞恶性转化也许性。

　　当前，普遍以为间充质干细胞“不致瘤”或具备“弱致瘤性”，但不排除其对已存在肿瘤“促瘤性”作用。

因而，建议依照各自间充质干细胞制剂组织来源和临床适应证不同，设计相应实验办法，以判断其制剂“促瘤性”。

　　1.3生物学效应

　　随着研究进展，建议针对临床治疗适应证，不断研究更新生物学效应检测办法。

如研究介导临床治疗效应核心基因或蛋白表达，并以此为基本提出与预期生物学效应有关代替性生物标志物（SurrogateBiomarker）。

　　2.干细胞制剂稳定性研究及有效期拟定

　　应进行干细胞制剂在储存（液氮冻存和细胞植入前暂时存储）和运送过程中稳定性研究。

检测项目应涉及细胞活性、密度、纯度、无菌性等。

　　依照干细胞制剂稳定性实验成果，拟定其制剂保存液成分与配方、保存及运送条件、有效期，同步拟定与有效期相适应运送容器和工具，以及合格细胞冻存设施和条件。

　　3.迅速检查办法研发

　　应依照新干细胞基本及实验技术研究成果，针对各自干细胞制剂特性、特定临床适应证，研发新迅速检查办法，用于干细胞制备过程各阶段质量控制和制剂放行检查。

　　三.干细胞制剂临床前研究

　　应进行干细胞制剂临床前研究，为治疗方案安全性和有效性提供支持和根据。

　　在临床前研究方案中，应设计和提出与适应证有关疾病动物模型，用于预测干细胞在人体内也许治疗效果、作用机制、不良反映、适当输入或植入途径和剂量等临床研究所需信息。

　　应在适当动物模型基本上，研究和建立干细胞有效标记技术和动物体内干细胞示踪技术，以便于研究上述内容，特别是干细胞体内存活、分布、归巢、分化和组织整合等功能研究。

在综合动物模型研究基本上，应对干细胞制剂安全性和生物学效应进行合理评价。

　　鉴于干细胞治疗特殊性，其临床前安全有效性评价具备较大难度和局限性，如下只提出某些基本原则，详细研究方案可依照这些原则制定。

如进行有关研究工作与下述原则不符，应提供相应根据和支持性资料。

　　1.毒性实验

　　可通过适当动物实验模型观测干细胞制剂各种也许毒性反映，如细胞植入时和植入后局部和整体毒性反映。

　　如难以采用有关动物评价人干细胞毒性，可考虑尽量模仿临床应用方式，采用动物来源相应干细胞制剂，以高于临床应用剂量回输动物体内，观测其毒性反映。

　　2.异常免疫反映

　　对干细胞制剂特别是异体来源、经体外传代培养和特殊解决自体或异体来源制剂，应当通过体外及动物实验评价其异常免疫反映，涉及对不同免疫细胞亚型及有关细胞因子影响。

对胚胎干细胞及iPS细胞，在体外诱导分化后重新表达供体HLA抗原分子，植入体内后也许形成免疫排斥反映，需进行有效评价。

　　3.致瘤性

　　对高代次或通过体外复杂解决和修饰自体来源以及各种异体来源干细胞制剂，应当进行临床前研究阶段动物致瘤性评估。

建议选取适当动物模型，使用适当数量干细胞、合理植入途径和足够长观测期，以有效评价制剂致瘤性。

　　4.非预期分化

　　非预期分化涉及非靶细胞分化或非靶部位分化。

建议运用特定检测技术，在体内动物实验中研究、评估和监控干细胞非预期分化也许性。

　　1.细胞模型（见前述-干细胞制剂质量研究）

　　2.动物模型

　　用于观测植入干细胞或其分化产物变化模型中疾病病理进程；

研究干细胞归巢能力和免疫调节功能；

通过度析干细胞植入后，特定细胞因子和/或特定基因表达状况，提出代替性生物学效应标志物。

　　若所申请研究方案，因当前国际上干细胞生物学知识和技术方面局限性，无法提出有效体内动物模型研究内容，则应在临床前研究报告中进行全面细致阐明。

名词解释：

　　干细胞制剂（Stemcell-basedmedicinalproducts）：

是指用于治疗疾病或改进健康状况、以不同类型干细胞为重要成分、符合相应质量及安全原则，且具备明确生物学效应细胞制剂。

　　胚胎干细胞（Embryonicstemcell）：

源自第5-7天胚胎中内细胞团初始（未分化）细胞，可在体外非分化状态下“无限制地”自我更新，并且具备向三个胚层所有细胞分化潜力，但不具备形成胚外组织（如胎盘）能力。

　　成体干细胞（Somaticstemcell）：

位于各种分化组织中未分化干细胞，此类干细胞具备有限自我更新和分化潜力。

　　间充质干细胞（Mesenchymalstromal/stemcell，MSC）：

一类存在于各种组织（如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等），具备多向分化潜力，非造血干细胞成体干细胞。

此类干细胞具备向各种间充质系列细胞（如成骨、成软骨及成脂肪细胞等）或非间充质系列细胞分化潜能，并具备独特细胞因子分泌功能。

　　祖细胞（Progenitors）：

一类只能向特定细胞系列分化，并且只具备有限分裂增殖能力成体细胞。

　　前体细胞（Precursors）：

一类只能向特定终末分化细胞分化，较祖细胞更有限增殖能力成体细胞。

　　造血干细胞（Hematopoieticstemcell）：

具备高度自我更新能力和多向分化潜能造血前体细胞，可分化成红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞。

　　诱导多能性干细胞（Inducedpluripotentstemcell，iPS）：

一类通过基因转染等细胞重编程技术人工诱导获得，具备类似于胚胎干细胞多能性分化潜力干细胞。

　　胚胎干细胞系（Embryonicstemcellline）：

在体外培养条件下，可保持未分化状态持续增殖胚胎干细胞。

　　全能性（Totipotent）：

是初期数天胚胎中，具备分化成机体所有类型细胞和形成完全胚胎能力干细胞。

　　亚全能性（Pluripotent）：

是具备形成机体各种类型细胞，即所有三胚层来源细胞能力，但不具备形成胚外胎组织细胞能力。

　　多能性（Multipotent）：

是指具备形成机体内超过一种类型细胞能力，但往往是针对特定细胞系列。

　　滋养层细胞（Feederlayer）：

是指通过细胞-细胞互相作用，或分泌蛋白或其她物质，位于胚胎干细胞和iPS细胞培养底层，以支持这些干细胞生长动物源性或人源性细胞。

　　畸胎瘤（Teratoma）：

一种具有三个胚层组织细胞和分化组织良性肿瘤。

参照文献：

　　1.《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指引原则》（）

　　2.《中华人民共和国药典》，第三部。

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　　14.FDAGuidanceforIndustry-CurrentGoodTissuePractice（CGTP）andAdditionalRequirementsforManufacturesofHumanCells，Tissues，andCellularandTissue-BasedProducts（HCT/Ps）.

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