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生物分离笔记
∙生物分离原理与技术
2006-08-17
生物分离的基本概念
生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程，又称为下游加工过程。
生物分离过程的主要特点
n 常无固定操作方法可循
生物材料组成非常复杂
n 分离操作步骤多，不易获得高收率
培养液（或发酵液）中所含目的物浓度很低，而杂质含量却很高
n 分离进程必须保护化合物的生理活性
生物活性成分离开生物体后，易变性、破坏
n 基因工程产品，一般要求在密封环境下操作。
生物分离的一般工艺流程
发酵液→预处理→细胞分离→（细胞破碎→细胞碎片分离）
↙
→初步纯化→高度纯化→成品加工
注：
（1）胞内产物需经细胞破碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后，对余下的液体即可进行初步纯化。
（2）在初步纯化及其以前的各步操作，处理的体积较大，着重于浓缩，称为提取或分离；以后各步为精细的分离操作，着重于纯化，称为精制（或纯化）。
生物分离的各阶段的常用方法
（1）发酵液的预处理
n 加热
n 调pH
n 絮凝和凝聚
（2）固液分离
n 沉降
n 离心分离
n 过滤
n 错流过滤
（3）细胞破碎
n 机械法
高压匀浆、高速珠磨、
超声波破碎
n 非机械法
化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻结融化法、干燥法
（4）初步纯化
n 沉淀法
n 吸附法
n 萃取法
n 超滤法
（5）高度纯化
n 层析
亲和层析、凝胶层析、离子交换层析
n 电泳
n 结晶和重结晶
（6）成品加工
n 无菌过滤
n 去热原
n 干燥
冷冻干燥、喷雾干燥
n 制剂
生物分离方法的选择依据
n 传统生物药物（抗生素）
根据具体条件，通过小实验决定，选择时应考虑两个因素。
（1）抗生素的理化性质：
极性、酸碱性、溶解度等，了解其理化性质，通常利用纸层析和纸电泳的方法。
（2）抗生素的稳定性：
要了解它在什么样的pH和温度范围易受破坏。
纸层析
抗生素在某一种溶剂中的Rf值大，表明它在该种溶剂中溶解度大；相反，如Rf值小，则溶解度小。
如Rf为零，则说明不能溶解。
如抗生素在极性强的溶剂中有较大的Rf值，则表明该抗生素是极性化合物；而非极性抗生素在非极性溶剂中Rf值较大，在极性溶剂中Rf值较小。
纸电泳
通过纸层析判断为水溶性的抗生素，可用纸电泳法进一步判断其电离性质。
电泳结果与样品性质的判断见课本第六页表1-1。
生物分离方法的选择依据
n 基因工程药物
应根据目标蛋白和杂蛋白在物理、化学和生物化学方面性质的差异，如，生物特异性、分子量、等电点值和稳定性等。
当几种方法联用时，最好以不同的分离机理为基础，且前一种方法处理过的液体应能适于后一种方法的料液。
作业
n 胞内产物和胞外产物的分离纯化流程有何不同之处？
n 哪些方法比较适合生物物质的初步纯化？
哪些方法比较适合生物物质的高度纯化？
n 以抗生素为例说明，选择生物分离方法时主要要考虑哪些因素？
第十章 预处理及固液分离
第一节 发酵液（培养液）的预处理
预处理的目的
?
改变发酵液（培养液）的物理性质，以利于固液分离。
主要方法有：
加热、凝聚与絮凝、使用助滤剂。
?
去除发酵液（培养液）中部分杂质以利于后续各步操作。
预处理的方法
一、加热
加热是最简单和经济的预处理方法，即把发酵液（培养液）加热到所需温度并保温适当时间。
加热能使杂蛋白变性凝固，从而降低发酵液（培养液）的粘度，使固液分离变得容易。
但加热的方法只适合对热稳定的生物活性物质。
预处理的方法
二、凝聚和絮凝
凝聚和絮凝在预处理中，常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除。
其处理过程就是将一定的化学药剂预先投加到发酵液（或培养液），改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。
但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也是有差别的。
1．凝聚
凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。
凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理的物质带负电荷（如细胞或菌体一般带负电荷），因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。
常用的无机盐类凝聚剂有：
Al2（SO4）3?
18H2O（明矾）、AlCl3?
6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等；常用的金属氧化物类凝聚剂有：
Al（OH）3、Fe3O4、Ca（OH）2或石灰等。
2．絮凝
絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。
常用的絮凝剂有聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、、聚丙烯酸钠和聚苯乙烯磺酸。
影响絮凝效果的因素很多，主要是絮凝剂的分子量，絮凝剂用量，溶液pH，搅拌速度和时间等。
三、使用惰性助滤剂
工业生产中有时需加入某些固体物质，以加速过滤速度，提高滤液质量，这种能提高过滤速度的物质称为助滤剂
助滤剂的使用方法有两种：
①在过滤前先在过滤介质表面预涂（铺）一层助滤剂。
②助滤剂按一定比例均匀加入待过滤的料液中。
常用的惰性助滤剂有硅藻土、珍珠岩、混合助滤剂（硅藻土或珍珠岩与石棉）、纤维素和活性炭。
助滤剂的选择要点如下：
（1）粒度选择
（2）根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂的品种
（3）用量选择
四、去除杂蛋白质的其它方法
1．等电点沉淀
蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去。
2．变性沉淀
使蛋白质变性的方法有：
加热、大幅度改变pH，加有机溶剂（丙酮、乙醇等）、加重金属离子如Ag＋、Cu2＋、Pb2＋等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等及表面活性剂。
3．吸附
在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。
预处理的方法
五、不溶性多糖的去除
当发酵液中含有较多不溶性多糖时，粘度增大，液固分离困难，可用酶将它转化为单糖以提高过滤速度。
例如在蛋白酶发酵液加α－淀粉酶，将培养基中多余的淀粉水解称单糖，就能降低发酵液粘度，提高滤速。
预处理的方法
六、高价金属离子的去除
对提取和成品质量影响较大的无机杂质主要是Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋等高价金属离子，预处理中应将它们除去。
?
去除钙离子，常采用草酸钠或草酸。
?
镁离子的去除也可用草酸，但草酸镁溶解度较大，故沉淀不完全，也可采用磷酸盐，使生成磷酸钙盐和磷酸镁盐沉淀而除去。
?
除去铁离子，可采用黄血盐，形成普鲁士兰沉淀：
作业：
?
改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？
其简要机理如何？
?
除去发酵液杂蛋白的常用方法有哪些？
第二节 细胞破碎
一、概念
破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物得到最大程度的释放。
二、影响细胞破碎的因素
1、细胞壁的结构
2、破碎方法
细胞壁的结构
?
细菌
革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层（约20－80nm）组成，而革兰氏阴性菌肽聚糖层较薄，仅2－3nm，在肽聚糖层外还有两层外壁层。
外壁层约8－10nm，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，较难破碎。
?
霉菌
霉菌的细胞壁较厚，约100－250nm。
?
酵母菌
酵母的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎。
破碎方法
?
机械法
高压匀浆法
高速珠磨法
超声波破碎法
?
非机械法
化学法
酶解法
物理法：
渗透压冲击法、冻融法
干燥法
1、非机械法
A、高压匀浆法
适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。
不适用于高度分枝的微生物。
B、高速珠磨法：
利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨作用，使细胞破碎。
C、超声波破碎法：
实验室常用
影响因素：
频率、液体温度和粘度、处理时间等。
2、非机械法
A、化学法：
采用化学试剂处理细胞，溶解细胞或抽提细胞组分
B、酶解法
利用酶（溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等）反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的。
需与其它方法配合使用（辐射、渗透压冲击、反复冻融法等）
?
途径：
在细胞悬液中加酶或采用自溶作用
?
自溶作用：
利用微生物自身产生的酶来溶菌，而不需外加其它的酶
?
自溶的方法：
加热法、干燥法
C、渗透压冲击法
先把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂。
D、冻结-融化法
将细胞放在低温（-150C），然后在室温中融化，反复多次，细胞壁破裂。
E、干燥法
经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。
方法：
空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥
三、破碎率的评价
细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：
Y（%）=[（N0-N）/N0]×100
N0－原始细胞数量
N－经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量
目前N0和N主要通过下面的方法获得：
?
直接计数法
在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。
?
间接计数法
间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）。
通过做法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清中的蛋白质含量。
四、各种破碎方法的评述
?
高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。
但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。
因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。
?
非机械法一般仅适用于小规模应用。
渗透压冲击和冻结－融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。
干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性.
五、破碎方法的选择依据
?
处理量
高压匀浆和珠磨机处理量大，速度快，适用于工业生产
?
产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性以及产物在细胞中的位置
生化物质的稳定性
?
细胞的数量和细胞壁的强度
?
破碎程度
?
提取分离的难易
总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行权衡。
第三节 固液分离
?
固液分离：
是指将发酵液（或培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去。
一、固液分离设备
?
过滤设备
板框压滤机
真空鼓式过滤机
?
离心设备
过滤式离心机
沉降式离心机
1、过滤设备
?
板框过滤机
原理
特点 板框压滤机的过滤面积大，能耐受较高压力差，对不同过滤特性的料液适应性强，同时还具有结构简单，造价较低，动力消耗少等优点。
但这种设备不能连续操作，设备笨重，占地面积大，非生产的辅助时间长（包括解框、卸饼、洗滤布、重新压紧板框等）。
适用对象 广泛应用与培养基制备的过滤及霉菌、放线菌和酵母菌和细菌等多种发酵液的过滤。
2、离心设备
?
过滤式离心机
转鼓上开有小孔，转鼓内表面覆盖过滤介质，在离心力的作用下，液体穿过过滤介质经小孔流出，固体被截留在过滤介质表面。
主要用于处理悬浮液固体颗粒较大、固体含量高的场合。
?
沉降式离心机
转鼓上无小孔，不需要过滤介质，在离心力的作用下，固体沉降于鼓壁上，余下的即为澄清的液体。
适用于固体量较低（小于10％）的场合。
常用的沉降式离心机有碟式离心机和管式离心机。
二、过滤方式
?
常规过滤
料液流动方向与过滤介质（能使固液混合料液得以分离的某一介面）垂直。
?
错流过滤
料液流向平行于过滤介质。
过滤介质通常为微孔膜或超滤膜。
三、影响固液分离的因素
?
微生物种类
真菌的菌体大，固液分离容易，可采用鼓式真空过滤或板框过滤；细菌和细胞碎片小，固液分离较难，固液分离前要采用一些手段增大粒子。
?
发酵液黏度
固液分离速度与黏度成反比
?
其它因素
发酵液的PH值、温度和加热时间
四、固液分离的发展动向
改善固液分离的手段主要从下列三方面进行：
?
利用错流过滤
?
利用遗传工程的方法来改变菌体的大小和形状
?
采用双水相萃取处理细胞匀浆液
作业：
1.简述常用细胞破碎方法的原理、特点及适用范围。
2.简述常用过滤设备的原理、特点及适用范围。
第十一章 萃取技术
第一节 溶剂萃取
一、基本概念
¨ 溶剂萃取：
广义上指用溶剂将物质从固体或另一种互不相溶的溶剂中提取出来的方法。
前者称为液－固萃取（浸取），后者称为液－液萃取。
狭义的溶剂萃取是指液－液萃取。
¨ 料液：
溶剂萃取中，被提取的溶液。
F
¨ 溶质：
欲提取的物质.
¨ 萃取剂：
用以进行萃取的溶剂。
S
¨ 萃取：
料液中的溶质向萃取剂转移的过程。
¨ 萃取液：
萃取平衡后，含有溶质的萃取剂溶液。
¨ 萃余液：
被萃取出溶质以后的料液。
R
¨ 分配系数：
在一定温度、一定压力下，某一溶质在互不相溶的两种溶剂间分配时，达到平衡后，在两相中的浓度之比为一常数，这个常数称为分配系数。
¨ 萃取率：
萃取相中溶质总量占原始料液中溶质总量的百分比。
用于表示一种萃取剂对某种溶质的萃取能力。
。
¨ 分离因素：
在同一萃取体系内两种溶质在同样条件下分配系数的比值。
分离因素愈大（或愈小），说明两种溶质分离效果愈好，分离因素等于1，这两种溶质就分不开了。
二、萃取剂
¨ 常用萃取剂：
甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、甲苯、石油醚（按亲脂性递增）
¨ 萃取剂选择的原则：
1）对所需成分溶解度大，其它成分溶解度小。
根据相似相溶原理进行选择。
2）萃取剂与料液的互溶度愈小愈好
3）毒性小。
低毒性（乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯）、中等毒性（甲苯、甲醇）、强毒性（苯、氯仿）
4）经济、安全、腐蚀性低、沸点不高、挥发性小、便于回收
三、工业萃取的步骤和分类
四、乳化和破乳化
¨ 乳化：
发酵液经预处理和过滤后，虽能除去大部分非水溶性的杂质和部分水溶性杂质，但残留的杂质（如蛋白质等）具有表面活性，在进行溶剂萃取时，有机相和水相难以分层。
¨ 破乳方法
1）加入表面活性剂：
1231、PPB、亚油酸钠
2）加入电解质：
如氯化钠、硫酸铵
3）吸附法：
通过多孔性介质
4）高压电破乳：
5）加热
6）稀释法：
加入连续相
五、影响萃取的主要因素
¨ 乳化作用
¨ pH值：
影响弱酸或弱碱药物的分配系数和药物的稳定性。
¨ 温度和时间：
药物的稳定性、分配系数
¨ 盐析作用：
盐析剂与水分子结合，游离水分子减少，药物在水相中溶解度降低，易转入有机相；降低有机溶剂在水中的溶解度；萃余相比重增大，利于分相
¨ 溶剂的种类和用量及萃取方式
总结：
溶剂萃取法比离子交换法选择性好、比沉淀法分离程度高、比蒸馏法能耗低，便于连续操作，现已广泛用于抗生素、有机酸、维生素、激素等产物的提取上，但是普通的有机溶剂萃取法由于以下原因难于应用于蛋白质分离
（1）许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；
（2）蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
作业：
¨ 总结多级错流萃取和多级逆流萃取的异同。
¨ 名词解释：
萃取剂、萃取液、萃余液、分配系数、分离因素、乳化
¨ 溶剂萃取包括哪些步骤？
¨ 常用的萃取剂有哪些？
如何进行选择？
第二节 双水相萃取
一、概述
¨ 概念
双水相萃取是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。
¨ 双水相的构成
1、两种高聚物水溶液相互混合可产生双水相系统。
2、高聚物水溶液与低分子量化合物水溶液也可形成双水相系统。
¨ 双水相萃取的特点
1）含水量高（70％～90％），适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质且不易引起蛋白质的变性失活。
2）不存在有机溶剂残留问题。
3）易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。
这是其他分离技术无法比拟的。
二、相图
双水相的形成条件和定量关系常用相图表示。
P80是PEG/Dex体系的相图。
图中的曲线称为双节线，双节线以下的区域为均相区，以上的区域为两相区。
双水相系统的相图可由实验来确定。
三、影响双水相萃取的因素
¨ 聚合物的影响
在PEG/Dex体系中，PEG分子量的减少，会使蛋白质在两相中的分配系数增大，当PEG的分子量增加时，在质量浓度不变的情况下，亲水性蛋白质不再向富含PEG相中聚集而转向另一相。
¨ 体系中无机盐离子的影响
盐对带电大分子的分配影响很大。
如DNA萃取时，离子组分的微小变化可以使DNA从一相几乎从一相完全转移到了另一相。
生物大分子的分配主要决定于离子的种类和各种离子之间的比例。
在体系中加入适当的盐可大大促进带相反电荷的蛋白质的分离。
¨ 体系pH的影响
pH微小的变化有时会使蛋白质的分配系数改变2～3个数量级。
¨ 体系温度的影响
温度影响相图，同时影响分配系数和蛋白质的生物活性。
¨ 细胞浓度的影响
通常细胞浓度的增加，会降低细胞破碎后内含物的分配系数。
四、双水相萃取的应用
双水相萃取目前较多应用于胞内酶的提取和精制上。
用双水相萃取技术处理细胞匀浆液，既可方便地除去细胞碎片，还可使酶得到精制。
用双水相萃取胞内酶，PEG/盐系统应用的较广泛。
通常将目的蛋白质分配在上相（PEG），而细胞碎片分配在下相（盐），便于离心分离。
五、双水相提取胞内酶的具体操作：
1.萃取：
适量的细胞匀浆液与双水相体系（一般为PEG/盐）混合。
2.上下相的分离：
在萃取达到平衡后，就必须使上下相分离。
有两种方法：
重力沉降和离心分离。
3.多聚物的分离：
当目的蛋白是分配在PEG富集的上相中，相与相分离后，在上相中加入盐，形成新的双水相体系，在适当的条件下，蛋白质重新被萃取进入盐相，而大量的PEG得到回收，盐相中残余的PEG可用超滤或透析除去。
见P92图6－12和图6－11
第三节 超临界流体萃取
一、基本概念和原理
¨ 超临界流体萃取技术（简称SFE）：
是利用超临界流体作为萃取剂的一种高效萃取技术。
¨ 临界点：
物质气液不分（既有气体的性质,又有液体的性质）的状态点。
物质具有固有的临界点,此状态点的温度Tc、压力Pc称为临界温度和临界压力。
当气体物质处于它的临界温度和压力以上,无论施加多大的压力,也不可能使其液化。
¨ 超临界流体（简称SCF）：
处于临界温度和压力以上的流体。
¨ 超临界流体的特性：
1.既有气体的性质（易于扩散和运动，黏度小，因此传质速率高，短时间间内就能达到萃取平衡）,又有液体的性质（密度大，溶解度大）。
2.溶解能力随密度的增大而增大，而密度与压力和温度直接相关，因此压力和温度的变化会大大改变其溶解能力。
超临界流体萃取正是利用这种性质，在较高压力下，将溶质溶解于流体中，然后降低流体溶液的压力或升高流体溶液的温度，使溶解于超临界流体中的溶质因其密度下降溶解度降低而析出，从而实现特定溶质的萃取。
¨ 超临界CO2流体的特性
1.超临界温度（Tc=31.06度）是所有溶剂中最接近室温的。
因此操作可在接近室温的情况下进行。
2.超临界压力（Pc＝7.39MPa）也适中。
3.临界密度是常用超临界溶剂中最高的。
因此溶解能力强。
4.无毒、惰性、无残留、价廉。
所以超临界CO2流体是应用最广泛的超临界萃取溶剂。
二、超临界萃取的过程和典型流程
¨ 超临界流体萃取的过程
由萃取阶段和分离阶段组合而成的。
在萃取阶段,超临界流体将所需组分从原料中提取出来。
由萃取釜和加压装置组成。
在分离阶段,通过变化温度或压力等参数,或其他方法,使萃取组分从超临界流体中分离出来,并使萃取剂循环使用。
由分离釜和减压装置组成。
¨ 三种典型流程
1.等温法：
是通过变化压力使萃取组分从超临界流体中分离出来。
含有溶质的超临界流体经过膨胀阀后压力下降,对溶质的溶解度下降。
溶质析出由分离釜底部取出,充当萃取剂的气体则经压缩机送回萃取釜循环使用。
2.等压法：
是利用温度的变化来实现溶质与萃取剂的分离。
含萃取质的超临界流体经加热升温使萃取剂与溶质分离,由分离釜下方取出溶质。
作为萃取剂的气体经降温升压后送回萃取釜使用。
3.吸附法：
是采用可吸附溶质而不吸附超临界流体的吸附剂使萃取物分离。
三、超临界萃取过程的影响因素
¨ 压力
当温度恒定时,提高压力可增大超临界流体的密度,从而提高超临界流体的溶解能力和萃取容量。
¨ 温度
当萃取压力较高时,温度的提高可以增大溶质扩散系数。
但温度提高也会降低超临界流体密度从而减小其萃取容量,温度过高还会使热敏性物质产生降解。
¨ 流体密度
溶剂的溶解能力与其密度有关,密度大,溶解能力大,但密度大时,传质系数小。
¨ 溶剂比
当萃取温度和压力确定后,溶剂比是一个重要参数。
在低溶剂比时,经一定时间萃取后固体中残留量大。
用非常高的溶剂比时,萃取后固体中的残留趋于低限。
溶剂比的大小必须考虑经济性。
¨ 颗粒度
一般情况下,萃取速率随固体物料颗粒尺寸减少而增加。
作业
1.超临界CO2流体为什么会是应用最广泛的超临界萃取剂？
2.综述超临界萃取在生物和食品工业的应用。
3.简述超临界流体萃取技术的原理。
4.结合课本P92图6－12，
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