细胞治疗企业如何贯彻执行GMP与中国药典.pdf

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细胞治疗企业如何贯彻执行GMP与中国药典微生物污染控制与检测技术探讨默克密理博生物监测栗壮默克创新引领生活默克是一家全球领先的医药与化工公司，以创新和高科技优质产品闻名世界。

默克在全球66个国家与地区拥有约39,000名员工，致力于改善患者的生活质量，助力客户实现长远的成功和迎接全球化挑战。

2默克公司历史1668弗雷德里克雅各布默克（FriedrichJacobMerck,1621-1678）购买天使药房1827埃曼鲁埃尔默克（EmanuelMerck，1794-1855）开始工业化生产1880产品范围扩大和国际化；首次完成药品成药的生产1904首次进军液晶业务领域1918第一次世界大战后失去包括默克美国分公司在内的部分财产1933在上海建立了第一个中国子公司1995默克公司上市，默克家族仍为最大股东，保持70%股权2001默克在北美的业务活动以EMD的名义重新开始2007收购雪兰诺公司，成立默克雪兰诺2010收购密理博公司,成立默克密理博2014收购安智电子材料公司默克将在2018年迎来350周年生日！

32014发起收购SigmaAldrich公司2014默克与辉瑞就抗癌药物达成合作2014默克第四届“未来视界”学术论坛在上海举行，引领显示行业新趋势2014默克收购安智包括其在中国的分支机构默克在中国1888威利默克到中国旅行1887首次有记载的业务往来1994默克进入中国1953与一家香港贸易公司达成代理协议，服务中国及香港1997默克（上海）贸易有限公司在上海成立1996建立默克有限公司（香港）2010收购密理博（包括中国的六家办事处）2013液晶中国中心在上海开业2011收购北京清大天一科技有限公司1933默克化工有限公司在上海成立怡默克上海办公室-1933默克在中国的价格表-1936收购清大天一-2011默克在华80周年庆-20132015默克投资（中国）有限公司正式启动三大业务领域5高性能材料医疗保健生命科学包括以下业务默克雪兰诺消费者健康阿罗格生物仿制药包括以下业务默克密理博2014年宣布收购西格玛奥德里奇公司包括以下业务高性能材料2014年收购并成功整合安智电子材料公司实验室分析生物监测产品（BioMonitoring）QC:

微生物实验QC,生产：

环境监控OneTeam,OneFamily7细胞治疗企业如何贯彻执行GMP与中国药典？

干细胞临床研究管理办法（试行）请根据报告内容更新9自体免疫细胞（T细胞、NK细胞）治疗技术管理规范请根据报告内容更新10药品生产质量管理规范（GMP）药品生产质量管理规范（GoodManufacturePracticeofDrugs，GMP）是药品生产和质量管理的基本准则，适用于药品制剂生产的全过程和原料药生产中影响成品质量的关键工序。

请根据报告内容更新11第一章总则第二章质量管理第三章机构与人员第四章厂房与设施第五章设备第六章物料与产品第七章确认与验证第八章文件管理第九章生产管理第十章质量控制与质量保证第十一章委托生产与委托检验第十二章产品发运与召回第十三章自检第十四章附则中国药典中国药典是药品研制、生产、经营、使用和监督管理等均应遵循的法定依据。

所有国家药品标准应当符合中国药典凡例及附录的相关要求。

请根据报告内容更新12第一部中药第二部化学药品第三部生物制品第四部附录的核心第三条本规范作为质量管理体系的一部分，是药品生产管理和质量控制的基本要求，旨在最大限度地降低药品生产过程中污染、交叉污染以及混淆、差错等风险，确保持续稳定地生产出符合预定用途和注册要求的药品。

背景一百多年来，人们努力提高在“有菌的环境”生产“无菌产品”的能力，事实证明这一努力至今仍充满挑战。

Presentationtitleinfooter|00Month000014什么是污染？

污染就是指当某物与不洁净的或腐坏物接触或混合在一起使该物变的不纯净或不适用时，即受污染。

简单的说当一个产品中存在不需要的物质时，它即受到了污染产品污染的类型：

-17-微生物污染的来源原辅料内包装容器配料用水生产环境制造工艺操作人员产品目录1、生产环境微生物监控2、原辅料微生物污染控制3、配料用水微生物监控4、终产品无菌检查生产环境微生物监控-20-生产环境洁净区洁净区是一个对空气尘埃粒子浓度进行控制的区域该区域的建造结构、装备及使用能够截留粒子而且会尽可能地减少粒子向该区域的介入可根据需要对该区域的温度、湿度以及压差等参数进行控制请根据报告内容更新21GMP附录1无菌药品请根据报告内容更新22GMP附录1无菌药品ISO14644-1:

洁净室定级Presentationtitleinfooter|00Month000023ISO14644-1:

洁净室尘埃粒子定级Class0.1mmm0.2mmm0.3mmm0.5mmm1mmm5mmmISO1102ISO210024104ISO31,000237102358ISO410,0002,3701,02035283ISO5100,00023,70010,2003,52083229ISO61,000,000237,000102,00035,2008,320293ISO7352,00083,2002,930ISO83,520,000832,00029,300ISO935,200,0008,320,000293,000每立方米的尘埃粒子数量24FDAISOChinaGMP4.8A（5m）1005A（0.5m）B10006100007C1000008D尘埃粒子检测设备洁净室定级、关键区域环境监测计划的重要组成部分洁净区级别确认原则：

根据房间的大小和级别来确认采样方法方法：

（a）采样点数量（b）最小采样体积ISO14644-1采样点数量采样点的数量如何计算?

ISO14644-1-1999有一个简单的计算方法:

A=房间的地面面积/mNL=最小的采样点数量保证采样点均匀分布，并位于工作活动的高度例如对于一个16m的房间:

-4个采样点，ISO50.5micron-检测限度为3520个/mP1P2P3P427ANLISO14644-1采样体积采样体积如何计算?

ISO146441规定:

Vs=每一个点的最小采样体积,单位是升Cn,m=最大粒径颗粒的限度值20=常数-例如：

对于ISO55.0m:

Vs=20/29x1000=690升房间确认/验证时最小采样体积列表ISO洁净级别ISO洁净级别最小单次100LPM2.83LPM1CFM采样体积采样时间采样时间采样时间LMinMinMin4.810001035335569072442576,8312,5180,6811129ISO14644-1的其他要求:

1、采样量要足够大，保证能检测出至少20个粒子；2、每个采样点每次的采样量至少为2升；3、采样时间最少为1分钟。

根据根据ISO14644对洁净室进行验证对洁净室进行验证确认/验证=证明洁净室符合下列要求:

选择两个粒径级别，且D21.5D1最小采样点数量最小采样体积Vs=20x1000/Cn,m当只要求一个采样点时，则在该点最少进行3次采样对应各自粒径级别，分别计算每个点的平均值31ANL接受标准只有在所有采样点的平均值和95%UCL值都符合限度的情况下，才能说验证结果合格如果采样点数1&75%forparticlesof=1.4m）b）生物效率（95%）脱水率对于微生物检测来说，影响微生物生长的重要因素之一就是培养基的含水量。

在浮游菌采样的过程中，由于培养基会直接暴露在流动的空气中，因此培养基脱水就在所难免。

控制培养基脱水在可接受的范围内，确保微生物的恢复生长率。

Feller校验Feller校验源于1950年，Feller,W的一篇关于概率论及其应用的论文当浮游菌采样时，随着空气中浮游菌数量的增加，多个微生物通过同一个采样孔撞击到培养基表面并同时生长的概率也会增加。

因此，统计学意义的微生物含量同平皿上得到的菌落数及采样头开孔数量的多少有关。

具体统计学数据如下：

Pr=N1/N+1/N-1+1/N-2.1/N-r+1Pr=统计学意义的微生物含量N=开孔的数目r=平皿上得到的菌落数。

由这一公式可以发现：

开孔数量越多，则平皿上的菌落数越接近于实际空气中的含菌量。

沉降菌检测的注意点：

摆放位置和高度（防止抑制物质的引入）采样本身引入的污染（外表清洁，培养基质量，摆放位置和人员）培养基的脱水问题（新鲜培养基和摆放时间）49Envirocheck环境监测标准平皿沉降菌取样监测方法表面微生物监测和人员卫生监测1、接触碟取样适用于平整的规则性表面属于定量检测方法Envirocheck环境监测接触皿表面微生物请根据报告内容更新512、棉签取样适用于不规则表面属于定量检测方法3、表面冲洗法适用于大表面积生物负载检测属于半定量检测方法Presentationtitleinfooter|00Month000054培养基和培养条件必须具有广谱性全能型培养基TSA（胰蛋白胨大豆琼脂）专用于酵母菌和霉菌分离生长的特定培养基SDA（沙氏葡萄糖琼脂）表面监测用培养基（加入中和剂和生物酶制剂）洁净室空气中残存消毒剂成分，对培养基表面捕获的微生物生长产生抑制作用。

需要选用添加相应中和剂和生物酶制剂的培养基来进行日常检验。

通常不必监测严格厌氧菌，因为其不会在室内空气中存活（USP1116）培养基及培养条件培养条件采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在3035摄氏度培养箱中培养，时间不少于2d；采用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿经采样后，在2025摄氏度培养箱中培养，时间不少于5d。

请根据报告内容更新56GBT16293-2010医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法压缩气体微生物/尘埃粒子检测ISO8573压缩气体的作用企业应根据需要配备气体系统，包括压缩空气系统和惰性气体系统。

其中压缩空气通常用于设备驱动，以及在洁净区用于吹洗、净化，而惰性气体（通常为氮气）用于将产品同氧气隔离以提高产品的稳定性或增强产品耐受热处理（如湿热灭菌）的能力。

Presentationtitleinfooter|00Month000058覆盖密封:

在物料表面保持一个常规的保护膜.过程中保护产品包装（原材料）清洗，冲洗:

填充和冲洗罐冲气，起泡以小泡的方式去除液体中的氧气搅拌混合以及储存液体压缩气体的使用点质量要求压缩气体的作用作为动力源作为原料质量标准的制定关键要看是否与产品接触其中接触又分为直接和间接接触选择再好的压缩气体系统也不足以保证气体的质量，压缩气体系统要定期地监控和维护。

Presentationtitleinfooter|00Month000060ISO8573压缩气体压缩空气标准（ISO8573）包括以下9个部分：

85731污染物和纯度级别85732含油量测定85733水分测定85734固体颗粒测定85735油蒸气和有机溶剂测定85736气体污染物测定85737微生物含量测定85738固体颗粒测定（质量浓度法）85739液体水含量测定压缩气体尘埃粒子检测W.Vanlommel,WarsawMay20116263压缩气体微生物检测Presentationtitleinfooter|00Month000064压缩气体微生物检测Presentationtitleinfooter|00Month000065预设气体类型：

空气，氮气，二氧化碳，氩气，氧气原辅料微生物污染控制GMP中关于原辅料的要求请根据报告内容更新67原辅料微生物负荷定义：

原料或者中间产品在灭菌工艺前的固有的微生物数量和种类。

但是，在实际生产中，容器，环境，清洗残留，时间等等因素都会引起微生物数量和种类上的变化。

原辅料微生物负荷会引起多种生产危害：

如：

影响过程工艺和终端产品的质量在最终产品中引入微生物的污染影响灭菌效果引发内毒素水平的变化物料的监控薄膜过滤法铺平板法划平板法表面的监控接触皿法冲洗法棉签法原辅料微生物负荷监控方法方法对比71直接接种法直接接种法薄膜过滤法薄膜过滤法样品处理量有限，通常为12ml允许测试大体积样品，1毫升至数升菌落小，不容易识别膜片上的菌落更容易识别低灵敏度更敏感，可达：

1CFU有抑菌问题有效去除样品中抑菌成分每次需要倒大量的平板准备时间少，可提前准备好培养皿不易观察容易观察，在24小时内即可提供（有/无）信息接种量少，不能够分离和增殖不连续的细菌菌落能够分离和增殖不连续的细菌菌落接种后不能够冲洗膜片表面可以冲洗配料用水微生物监控制药用水纯化水采用循环方式保存（2010版GMP）注射用水注射用水可采用70以上保温循环（2010版GMP）灭菌注射用水2010版GMP第一百条应当对制药用水及原水的水质进行定期监测，并有相应的记录。

第一百零一条应当按照操作规程对纯化水、注射用水管道进行清洗消毒，并有相关记录。

发现制药用水微生物污染达到警戒限度、纠偏限度时应当按照操作规程处理。

请根据报告内容更新73原水制药用水的原水通常为饮用水，要求符合GB5749-2006生活饮用水卫生标准检测方法参照GBT5750.12-2006生活饮用水标准检验方法微生物指标742015版中国药典制药用水国家标准-纯化水2010版2015版检测项目细菌数霉菌酵母菌总数需氧菌总数检测量未规定不少于1ml检测方法薄膜过滤法薄膜过滤法培养基营养琼脂3035培养3天玫瑰红钠琼脂2328培养5天R2A琼脂培养基3035培养不少于5天国家标准每1ml细菌、霉菌酵母菌总数不得过100个每1ml供试品中需氧菌总数不得过100cfu请根据报告内容更新752015版中国药典制药用水国家标准-注射用水2010版2015版检测项目细菌数霉菌酵母菌总数需氧菌总数检测量至少200ml不少于100ml检测方法薄膜过滤法薄膜过滤法培养基营养琼脂3035培养3天玫瑰红钠琼脂2328培养5天R2A琼脂培养基3035培养不少于5天国家标准每100ml细菌、霉菌酵母菌总数不得过10个每100ml供试品中需氧菌总数不得过10cfu请根据报告内容更新76微生物全自动过滤系统MilliflexPlus全自动过滤系统简单易用的维护操作方式卫生级材料便于清洁更短的样品处理时间过滤100毫升纯水仅需10秒钟良好的微生物恢复生长率节约您的实验室空间内置隔膜泵，优化您的实验环境内置称重系统，精确到1g77方案1：

Milliflex标准配置全自动过滤系统，一次性封闭无菌耗材，降低污染风险78方案2：

Milliflex简易配置简单易用，方便操作，减少假阳性79方案3：

Milliflex简易配置简单易用，方便操作，减少假阳性微生物半自动过滤系统EZ-Family微生物过滤系统80EZ-Fit过滤支架：

手工拆卸，易于清洁提供多种快接式过滤底座适用于多种过滤工具EZ-Curve全自动取膜器：

红外感应取膜避免污染风险膜片放置位置可自动调整内置锂电池，无需外接电源膜片易于安装EZ-Stream直排式真空隔膜泵：

直接排出，无需处理废液高效过滤速度精简小巧，静音设计，无需维护保养EZ-Family微生物过滤系统81Presentationtitleinfooter|00Month000082方案4：

EZ-Family标准配置专用一次性无菌滤杯，优化实验流程，节约工作时间方案5：

EZ-Family经济配置方便与快捷的全新组合，操作简单，易于清洁消毒终产品无菌检查1、检测环境请根据报告内容更新842010版2015版应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内或隔离系统进行B+A或隔离器应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区域内或隔离系统中进行，日常检验还需对试验环境进行监控。

CLASSBroomLFH（classA）2、环境监测要求新增：

9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则请根据报告内容更新85注：

每月一次3、培养基配制后的培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌；制备好的培养基应保存在225、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

培养基请根据报告内容更新872010版2015版1、硫乙醇酸盐流体培养基3035C；2025C（三部）2、改良马丁培养基2328C3、选择性培养基4、0.5%葡萄糖肉汤培养基5、营养肉汤培养基6、营养琼脂培养基7、改良马丁琼脂培养基1、硫乙醇酸盐流体培养基3035C；2025C培养2、胰酪大豆胨肉汤培养基（TSB）2025C3、选择性培养基4、0.5%葡萄糖肉汤培养基5、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）6、沙氏葡萄糖肉汤培养基7、沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基体系与国际接轨，改变以往微生物分类培养的错误，正确考虑培养基的广谱性4、供试品的无菌检查无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。

只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。

供试品检查方法应与方法适用性试验确认的方法相同。

若使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。

88薄膜过滤法请根据报告内容更新892010版2015版薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器。

薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。

水溶液供试品取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。

如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用适量的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不得少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。

水溶液供试品内容未变化增加：

除生物制品外，一般样品冲洗后，1份滤器加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。

生物制品样品冲洗后，2份滤器加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。

必须使用封闭式薄膜过滤器分别给出一般产品和生物制品薄膜过滤的不同操作方法曾经发现个别品种在2025培养的硫乙醇酸盐流体培养基中有菌生长直接接种法请根据报告内容更新902010版2015版直接接种法即取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中新增：

除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的支/瓶数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：

1。

给出一般产品和生物制品直接接种的不同操作方法首选薄膜过滤法，不提倡直接接种法无菌检查91封闭式无菌检测系统SteritestSymbio专业设计，以便匹配您的测试环境通过一步一步的支持，实现较高的测试重复性广泛全面的服务，可满足您的合规性要求可靠易于使用的独特设计安全92一次性过滤装置SteritestEZ&SteriSecure符合各种不同产品的套筒选择可靠的质量保证更人性化的设计使操作更简便安全93SteritestEZ分类蓝色底座套筒不含抑菌成份并且易于过滤的产品红色底座套筒含抑菌成份的产品绿色底座套筒难溶性或不易过滤的产品94无菌检查培养基及缓冲液TRYPTICSOYABROTH（100ML12/PK）TSBFLUIDTHIOGLYCOLLATEMEDIA（100ML12/PK）FTMFluidA（100ML12/PK）/（300ML4/PK）FluidD（300ML4/PK）FluidK（300ML4/PK）FLUIDTHIOGLYCOLLATE（500）TRYPTICSOYABROTH（500g）95默克密理博96栗壮18620673011L