HP1100高效液相色谱仪验证方案Word文档格式.docx
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柱温箱:
VWD多波长检测器:
8.1.1仪器情况
仪器名称
仪器型号
仪器厂家
仪器编号
仪器精密度
咼效液相色谱仪
HP1100
水银温度计
0-100C
1/万电子天平
AEG-120G
填表人/日期:
8.1.2验证用仪器校正情况和结果
校正日期
校正结果
校正有效日期
校验单位
8.2验证用试剂的准备
试剂名称
来源
100%纯水
水处理室
咖啡因Caffeine标准品组
美国惠普
部门:
填表人/日期:
8.3验证步骤
8.3.1验证的准备工作
(1)将限流毛细管(HP物料编号5022-2159)安装到装色谱柱位置。
(2)开始OQ/PV程序前24小时打开检测器灯管,达到最佳的检测器稳定性的状态。
(3)将管道A注入纯水。
(4)打开分析管柱温控箱的开关,将两个热交换器的温度设定在40C。
(5)把温度表探头安装在柱温箱的热交换器上。
(6)打开清洗阀,以5ml/min流速将A管道至少清洗10分钟以上。
(7)关闭泵与清洗阀。
(8)调节流量1.0ml/min的纯水(100%)通过检验器,继续其他安装程序待系统达到平衡。
(9)将OQ/PV咖啡因标准品依照表1的位置装到手动进样器旁边。
8.3.2波长准确度测试
原理
波长的准确度可利用测定一已知其光谱的化合物来加以得知。
在特定的波长下,光谱某
一特定波段一定会出现,此一波段与特定波长的偏差则可视为检测器的不确度。
本测试所
用的标准品为浓度25ug/ml的咖啡因溶液。
咖啡因在272nm波长时有最大吸收,而在244nm有最小吸收,这两个波长即用以验证UV检测器的波长准确度。
可变波长检测器(VWD:
先在水流过检测器、流动池时作一空白扫描,然后以自动进样方式将咖啡因注入流动池中。
作波长扫描,空白光谱会自动扣除。
设备
HP1100系列的单元泵,手动进样器,配有温度控制之可变波长检测器。
测试条件
方法:
HPOQ/PV之波长准确性测试
.流动相A:
纯水。
流量1.0ml/min。
.柱温箱温度:
40C。
.限流毛细管2M*0.12mmi.d.
.标准品#3(25ug/ml)咖啡因,用注射器按编号注射到手动进样器里。
.运行方法,其结果自动记录并显示测试结果。
测试评估
所测得最大/最小波长与预期的最大/最小波长之间的偏差会自动计算,测得结果列入
OQ/PVB告中。
认可标准及结果
名称
最大波长1
最大波长2
最小波长
最大偏差标准
<
2.0nm
测定值
测得最大偏差
结论
签名/日期:
复核/日期:
8.3.3HolmiumOxide氧化钦测试(检测器)
检测器波长校正准确度可以借助测量一已知化合物的光谱来加以求取,在特定波长下,光
谱应该显示特定的波段,此一波段与给定波长间的差值,即可视为检测器的不准确度,建具有最大特性吸收的氧化钦滤光器则可用于决定波长准确度。
可变波长检测器(vwd:
vw[利用下列氧化钦的三个最大波长来测定波长准确度:
.360.8nm
.418.5nm.536.4nm
氧化钦测试会进行建氧化钦滤光器的扫描,求取最大吸收波长与期望波长之差值,为了避
免吸收溶剂的效应,此一测试是在流动池充满水的情况下进行。
HP1100系列的单元泵,手动进样器,配置Chemstation控制的可变波长VWD佥测器
认可标准
波长准确性w2.0nm
HPOQ/PV之氧化钦测试.
.纯水置于管线A中
.100%A,流量1ml/min
.柱温箱之温度:
准确度可由最大吸收时的测量波长与理论波长的偏差来检定。
在特定波长围,测出最小及
最大光源强度,并自动与合格规值作比较,结果将列验证报告中。
要求值(nm)
标准差值
测定值(nm)
测得差值
.8
w2.0nm
8
.5
w2.0nm
6
.4
36
41
53
签名/日期:
复核/日期:
8.3.4
检测器响应线性测试
当光吸收的量超过某一限度时,吸收检测器即呈现非线性现象。
造成非线性现象主要原因
是散光,在较高的吸收时,散光变得重要,对检测器的应答影响就愈重要。
线性的测试方法是在不同样品瓶中放入不同浓度的咖啡因标准品(依序增加浓度),每
样品瓶注入多次,每次注入相同体积,色谱图应该得到面积愈来愈大的波峰,当这些波峰的面积(或高度)对浓度作图时,应得到一条通过原点的直线。
HP1100系列的单元泵,手动进样器,配有温度控制的可变波长检测器。
.方法:
HPOQ/PV之检测器线性测试
顺序:
。
进样量:
20ul
.管线A:
HPLC级纯水
.流量1.0ml/min
.标准品#1,#2,#3,#4,#5依序放在手动进样器旁边1、2、3、4、5的位置上。
.检测波长:
273nm
将所得波峰面积(或高度)对浓度作图时,应得到一条通过原点的直线,实际上就是强迫
通过原点,线性回归的一条校正曲线,此一校正曲线的相关性(相关系数)即可作为测量
检测器的一种判断依据。
此直线斜率的倒数即是列印在校正表格中的应答因子。
理论上每
个浓度下的应答因子应是相同的。
因此针对这些应答因子所得的相对标准差即可作为测试
检测器线性的另一判断依据。
相关性标准>0.999
位
置
样品名
针数
样品浓度/峰面积
标准浓度
结论
1
咖啡因1
0.5ug/ml
2
咖啡因2
1.0ug/ml
3
咖啡因3
5ug/ml
4
咖啡因4
25ug/ml
5
咖啡因5
50ug/ml
样品名称:
咖啡因
以峰面积与浓度可作出图如下:
Area
检测波长:
相关性:
公式:
Y=mx+b
m:
b:
x:
Amount(ng/ul)
Y:
►
Amount(ng/ul)
8.3.5杂讯、温度稳定性测试(检测器、柱温箱)
A.杂讯测试
杂讯,偏移及偏离是检测器的特定性能。
在分析极微量化合物时,检测器的杂讯低与否就
显得特别重要,偏移及偏离值对积分的品质影响最大。
紫外线/可见光(UV/Vis)吸收检测器的杂讯是采用ASTMASTME19.09方法来测试,ASTM杂讯测试是根据美国国家标准协会对测定液相色谱仪所用可变波长检测为之标准程序。
为尽可能测得实际的杂讯,选用水作测试溶剂(因为大多溶剂组合中都会用到水),
所选用的波长也是落在常用的波长围。
偏移基本上是温度所造成的,其主要的影响是在灯
管热机时(约1小时),在进行ASTM杂讯测试时,为避免温度(偏移)的效应,必须至少在24小时前打开灯管。
B.度稳定性测试
为测试温度稳定性,在杂讯测试时即可使用一部温度感测器将温度不断记录下来。
理论上,
在测试过程中,温度讯号应该保持稳定,最大温度与最小温度的差距即可视为温度讯号的
稳定性。
HP1100系列单元泵,手动进样器,配置有Chemstation控制的VWD佥测器。
HPOQ/PV
.HPLC级纯水置于管线A中
.100%A,流量1ml/min,运行时间:
20分钟
限流毛细管2M*0.12mmi.d.
首先,将讯号以每一分钟为区隔切割成20等份,每一等份的偏移可由回归线的线性斜率
求得。
其次,各时间等份平行线的波峰到波峰杂讯(垂直距离)可视为经偏移校正过的波
峰到波峰杂讯,所有波峰对波峰杂讯的平均值即为杂讯值。
偏移值是指20个时间等份平行线斜率的平均值。
偏离值的求取是将20个时间等份的中点连起来,将杂讯计算方式应用于此线即可求得。
所得的基准线杂讯、偏移及偏离值、设定温度的最大偏差值与可接受的标准相比较,自动
与OQ/PV系统建立时所定义的合格规值相比较,测试值会列入OQ/PVB告中。
测试项目
接受标准(限制)
测试结果
杂讯,温度准确性
ASTM杂讯[mAU]
0.40
偏移[mAU]
0.2
漂移[mAU/h]
0.5
温度稳定性左C
温度稳定性右C
杂讯测试结果
时间
杂讯
漂离
漂移
温度稳定性
由(分)至(分)
(6*SD)mAU
(Ptop)
(ASTM)
(mAU)
mAU/h
左C
右C
复核/日期:
8.3.6柱温箱温度准确性测试(柱温箱)
温度的准确度是借助一已事先校正过的外来温度计来检测,此留点温度计附在柱温箱热交
换器的测量点上,待系统平衡后,便读取温度计的温度,将此温度与柱温箱设定温度相比
较,并检测两者之差距是否在合格围。
此测试取25C,27C,40C,60C,65C五个温
度点。
.100%A,流量1.0ml/min
评估包括将外部温度计所量的温度与柱温箱的设定温度相减,比较差值是否在合格规值。
设定温度
标准偏差
测得温度
差值
左C右C
25C
30C
40C
50C
55C
60C
65C
8.3.7流量准确度/精确度测试(泵)
流量被定义为一定时间被送出的体积量;
在HP1100系列的泵系统中,流量则被定义为活
塞推送的速度。
确认流速的方法是将检测器的出口端直接注入一已知重量的容量瓶,通过
测量单位时间容量瓶重量的变化而折算出溶液的体积量。
•方法:
按设定的运行时间,检测器波长254nm
.顺序:
流量0.5ml/min、1.0ml/min、2.0ml/min、3.0ml/min
.纯水置于管线A中.流量1.0ml/min
.限流毛细管2M*0.12mmi.d..柱温箱温度:
40C。
将在不同时间检测器出口收集到的溶剂量-一体积可用以计算流量准确度,测量的流量与
其设定值比较。
认可标准准确性w5.0%精确度RSD嗨0.5%
流量准确性测试结果-1
流量:
0.500ml/分钟压力:
29.7bar
序
号
容量瓶重
(g)
时间
(s)
瓶重+水重
水重
(g)
温度
(C)
密度
(g/ml)
体积
(ml)
测得流量
(ml/min)
7
9
10
平均流量(ml/min):
RSD%
流量准确性测试结果-2
1.000ml/分钟压力:
59.8bar
平均流量(ml/min):
流量准确性测试结果-3
2.000ml/分钟压力:
118.5bar
流量准确性测试结果-4
3.00ml/分钟压力:
179.1bar
8.3.8进样器精确度与交叉污染测试(手动进样器)
A进样器精确度
进样器精确度的测试是利用注入多次相同体积咖啡因标准品的方法进行。
在相同注入体积
下,色谱图应该显示相同面积的波峰,这些面积和平均面积的偏差应该愈小愈好,此偏差
通常以面积标准差来表示,标准差与平均面积之比可得相对标准差。
相对标准差即可用以
作为精确度的测量,此数值最后再与可接受的标准围比较。
B交叉污染测试
为测试样品交叉污染的情况,首先注入一高浓度的样品,将充满于另一样品瓶中的溶剂注
入(溶剂与前次高浓度溶液相同)。
在理想的情形下,第二次注射分析结果不应有样品出
现,而第二次注射所出现的样品面积即可作为交叉污染的测定值指标。
HPOQ/PV之进样器精确度与交叉污染测试
顺序位置
浓度
进样量
图谱编号
空白
0.00
OQPVMNUPRC01
OQPVMNUPRC04
OQPVMNUPRC1C
检测波长273nm.
.管线A:
纯水
.标准品#4(25ug/ml咖啡因),放在手动进样器旁边位置4。
.HPLC级纯水(空白瓶),放在手动进样器旁边位置6。
每一个咖啡因波峰的面积、高度及停滞时间得到后,计算每一个波峰对平均值的相对标准差(RSD%。
进样器精确度与交叉污染认可标准
进样器精确度与交叉污染
精确度面积(RSD%
1.000
精确度高度(RSD%
2.0
交叉污染面积(RSD%
交叉污染高度(RSD%
0.4
进样器交叉污染测试结果
名称
前次运行
当次运行
交叉污染(%
峰面积
峰高
进样器精确度测试结果
运行序号
保留时间(min)
峰高(mAU
峰面积(mAU*S)
平均:
S.D
RSD
95%CI
九、验证结果及结论
9.1.验证标准及结果
1.VWDfe长准确性
最大波长1准确度[nm]
最大波长2准确度[nm]
最小波长准确度[nm]
2.氧化钦波长
波长准确性[nm]
3.温度准确性
左侧温度准确性边c
右侧温度准确性c
4.检测器线性
相关性
0.99900
5.杂讯,温度准确性
0.040
温度稳定性左c
温度稳定性右c
6.流量准确性/精确性
准确性(%
5.0
精确性(%
0.50
7.进样器精确度与交叉污染
附录:
分析所用方程式
回归分析
通常回归分析的方程式表示如下,线性
杂讯测试及测试线性时均使用回归分析进行评估,
则由线性方程式得来:
线性方程式:
Y(X)=a+b*X
其中N=观察值数目
Xi=自变数,
第
i个观察值
其中=因变数,
方程式1系数计算
b
N
(XiYi
其中a
1—1
N1
(Xi2
i1
Ni1
Xi
回归系数
(N*
XiY
其中
r
*
X
Xi*Yini1
’XiY
NN
XiY)2
i1i1
方程式2相对标准差(RSD的计算
标准差:
SD
YiabX
i