最新南京农业大学考研生化试验Word文件下载.docx
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3H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）
甘氨酸、盐酸、标准pH缓冲液（pH4.01、7.00、10.01）
2.
仪器
电子天平（感量0.001g）
pH计
3.
器材
容量瓶：
100mL×
2
量
筒：
50mL×
1
移液管：
10mL×
烧
杯：
100mL′1200mL′2
漏斗、洗瓶、洗耳球、移液管架、玻棒：
各1
四.
操作步骤
1.磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制（0.1mol/L，pH7.0）
（1）由附录“常用缓冲溶液的配制”表中通过计算，分别称取Na2HPO4·
12H2O
g，NaH2PO4·
2H2O
g，用蒸馏水溶解后，定容至100mL。
（2）将配好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用。
2.醋酸-醋酸钠缓冲液配制（0.1mol/L，pH5.4）
（1）0.1mol/L醋酸钠母液的配制：
称取NaAc·
3H2O
g，用蒸馏水溶解后，定容至50mL。
（2）0.1mol/L醋酸母液的配制：
吸取冰醋酸
mL，用蒸馏水定容至1000mL。
（3）取0.1mol/L醋酸钠母液43mL，0.1mol/L醋酸7mL，于烧杯中混匀，用pH计测定pH值，使混合液的pH值最终达到5.4。
（4）将配制好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用。
3.Tris-Gly-HCl缓冲液配制（0.025mol/L，pH8.3
）
（1）称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）0.300g，甘氨酸1.44g，加入80mL蒸馏水，加热溶解。
（2）冷却后，用pH计测定pH值，并不断滴加2.5mol/L盐酸，使pH值最终达到8.3。
（3）用蒸馏水定容至100mL。
（4）将配制好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用
五.
思考题
1.配制缓冲液时，选取合适的缓冲试剂，主要根据什么原则？
2.配制缓冲液，常用的方法有哪几种？
了解荧光法测定核黄素的原理和方法。
学习荧光光度计的操作和使用。
核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物，它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光。
这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。
核黄素可被亚硫酸盐等还原成无色的二氢化物，同时会失去荧光，因而检测样品时要防止荧光的衰减。
二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：
图2核黄素氧化还原机理图
核黄素的激发光波长范围约为440—500nm（一般为440nm），发射光波长范围约为510—550nm（一般为520nm）。
利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比，可进行定量测定。
根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。
注意：
在所有的操作过程中，要避免核黄素受阳光直接照射。
实验材料及设备
材料
核黄素药片
荧光光度计
天平（感量0.0001g）
普通试管：
25mL×
10
2（棕色）
1
5mL×
1mL×
50mL×
2
250mL×
滤
纸：
f11cm
滴
管：
2支
坐标纸、研钵、漏斗、洗瓶、洗耳球、试管架、移液管架、玻棒：
试剂的配制
核黄素标准液（5μg/mL）
准确称取核黄素10mg，加100mL浓度为1.71mol/L的醋酸和适量蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。
冷却至室温，用蒸馏水定容至2000mL。
转入棕色瓶中。
样品液的制备
（1）
取样：
取核黄素药片一粒，称重
g；
转入研钵中磨成粉。
（2）
定容：
加0.5mL冰醋酸和适量蒸馏水溶解，用蒸馏水定容至100mL。
（3）
过滤：
收集部分滤液于试管中。
（4）
稀释：
取滤液2mL于棕色容量瓶中，定容100mL，待测。
（本实验由于样品溶解后所剩残渣很少，残渣所占体积对定容体积100mL造成的误差可以忽略不计，所以采用先定容，后过滤操作过程，这样可以节省时间。
）
标准曲线制作及样品测定
取9支试管，按下表所示顺序操作。
注意:
在测定中如果待测样品溶液的荧光强度超出100%，则需要再行稀释，并记录稀释倍数或调节灵敏度。
六.
结果处理
1.由1～6号管的数据，以核黄素含量（mg）为横坐标，F值（F1-F2）为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；
2.求样品管F的平均值；
3.由从标准曲线中求样品管中核黄素的含量（μg）；
4.计算你所取生物材料中核黄素的含量（单位用μg/g鲜重）。
七.
为什么在核黄素的整个测定过程中，需要避光操作？
附注（荧光光光度计使用说明）
使用930型荧光光度计时：
核黄素荧光测定的激发光波长为440nm，发射光波为520nm。
因此可选用带通型400nm（蓝字）滤色片为激发光滤色片，选用截止型510nm（红字）滤色片为发射光滤色片。
待仪器预热并调好零点后，用参比溶液调荧光光度计的荧光强度读数到满刻度（100%），然后分别测定其它溶液的相对荧光强度F值。
使用F96型荧光光度计时：
需用“0”管的溶液调F=0.00，再分别测定其它的中溶液的F值。
了解赖氨酸总含量的测定方法。
掌握用比色法测定谷物类样品中赖氨酸含量。
蛋白质中的赖氨酸残基上具有一个游离的e-NH2，它与茚三酮起颜色反应呈蓝紫色，在波长570nm处其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸残基的含量成线性关系。
亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，它仅有的一个氨基（a-NH2）相当于蛋白质中赖氨酸残基上的e-NH2，因而可以用亮氨酸标准液制作标准曲线来测定蛋白质中赖氨酸的含量。
但计算浓度时必须乘上两种氨基酸的分子量之比（赖氨酸与亮氨酸分子量之比为1.11:
1）。
式中
W：
样品质量
C：
样品中游离氨基酸的量，各种作物种子中游离氨基酸的含量大约是：
玉米：
0.01%，高粱：
0.04%，水稻：
0.01%，小麦：
0.05%
X：
从标准曲线查得的赖氨酸的质量
玉米粉
分光光度计
分析天平
恒温水浴
刻度试管：
11
2mL×
20mL×
250mL×
2
洗耳球：
研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：
1.柠檬酸缓冲液（0.2mol/L，pH5.6）（参见附录二）
2.茚三酮试剂
称3g茚三酮溶于100mL95%乙醇中，溶解后加入160mg二氯化锡，搅拌溶解后加入100mL柠檬酸缓冲液中，搅匀备用。
3.亮氨酸标准液（50mg/mL）
准确称取5mg亮氨酸，用蒸馏水稀释定容到100mL，则得浓度为50mg/mL的标准液。
五.操作步骤
（1）取材：
称取烘干、粉碎（过80目筛）的玉米粉0.3g（油料种子须经脱脂处理）。
（2）提取：
将称取的样品放入试管，准确加入20mL蒸馏水，摇匀。
读取样品悬液的总体积
mL，置于80℃恒温水浴中提取20min。
（可间歇摇动）
（3）定容：
冷却后，用蒸馏水将试管中悬液定容至
（2）中悬液总体积刻度
mL,，即最终样品液总定容体积仍为20mL，摇匀。
（4）过滤：
将提取液用滤纸过滤，收集滤液作为待测样（滤纸不能用蒸馏水湿润）。
取9支刻度试管，按下表所示顺序操作。
六.结果处理
1.由0～6号管的数据，以亮氨酸含量（mg）为横坐标，A570为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；
2.求样品管A570的平均值570；
3.由530从标准曲线中求样品管中赖氨酸的含量（mg）；
4.计算你所取生物材料中赖氨酸的含量（单位用mg/mg样重）。
七.思考题
1.能否运用线性回归方程的方法，计算样品中赖氨酸的百分含量？
2.运用本实验方法测定含油份高的作物种子时，为什么对样品要进行脱脂处理？
分析本实验中可能引入误差的几个关键环节。
一.目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。
二.原理
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。
考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，其结构如下图。
它在游离状态下最大吸收波长为464nm。
由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。
当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595nm。
这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。
该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为5mg，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法。
但染料易吸附在比色杯上而造成误差，每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。
三.实验材料及设备
包心菜
离心机
电子天平
3.器材
9
3
离心管：
坐标纸
研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：
四.试剂的配制
1.牛血清白蛋白（BSA）标准液（100mg/mL）
精确称取10mg牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。
2.考马斯亮蓝G-250染色液
取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95%的乙醇中，加入100mL85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。
过滤待用。
该试剂于常温下可保存1个月。
称包心菜叶片1.0g左右，准确记录其质量
g。
（2）研磨：
将样品置于研钵中，研磨成匀浆后，准确加20mL蒸馏水。
（3）提取：
将上述匀浆液在研钵内浸提10分钟，不断搅拌，使蛋白质充分溶解在水中（注意，已定容，所以在没搅匀之前不能损失样液）。
（4）离心：
将部分浸提液转移到10mL离心管里，以10000转/分钟离心10分钟。
（5）分离：
将上清液倒入至干净的小试管里，备用。
（对于含水量比较多的样品，在计算定容体积时，还应考虑到样品本身的水份。
因此，另取1g左右的包心菜叶片，准确称重
g，在微波炉里高温失水，冷却后准确称重
g，计算包心菜叶片的含水量，然后再计算出所称样品中含有
g（mL）水，加上20mL水的体积，就是本实验样品的准确定容体积。
2.标准曲线制作及样品测定
1.由0～5号管的数据，以蛋白质含量（mg）为横坐标，A595为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；
2.求样品管A595的平均值A595；
3.由平均值A595从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量（mg）；
4.计算你所取生物材料中蛋白质的含量（单位用mg/g鲜重）。
1.用本实验方法所得的测定值与样品的实际值之间若有误差，主要是由什么原因引起的？
2.常见的测定蛋白质的方法还有哪些？
比较几种测定蛋白质常用方法的优缺点？
掌握滴定法测定Vc含量的基本原理和操作。
L-抗坏血酸（Vc）中的—C=C—基具有还原性，还原型L-抗坏血酸能与氧化剂染料2,6-二氯酚靛酚作用，染料本身被还原成无色的衍生物，同时还原态的L-抗坏血酸被氧化成无色的脱氢L-抗坏血酸。
一定量的样品提取液还原标准染料的量与样品中所含Vc的量成正比。
染料2,6-二氯酚靛酚在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈粉红色。
用2,6-二氯酚靛酚滴定样品，在达到终点之前，滴下的2,6-二氯酚靛酚立即被还原成无色；
当溶液中的L-抗坏血酸被消耗完时，滴下的过量的2,6-二氯酚靛酚在酸性体系里呈现粉红色。
所以当溶液从无色转变成微红色时，即为滴定终点。
1.材料
新鲜蔬菜
2.仪器
滴定管：
锥形瓶：
4
研
钵：
1套
洗
瓶：
1个
纱
布：
20cm×
20cm
1块
草酸溶液（2%）
每组配制250mL
2.2,6-二氯酚靛酚溶液
分别称取2,6-二氯酚靛酚300mg、碳酸钠300mg，用热蒸馏水200mL溶解并定容至3000mL（过滤除去难溶颗粒，置于棕色瓶中，贮于冰箱中备用。
有效期一周，使用前需标定，见附注。
1.样品液的制备
称取新鲜黄瓜10g左右，准确记录称样量
g,再称量2.5g草酸，与样品一起用纱布包裹住。
样品包置研钵中，加15mL2%草酸，用研棒挤压样包，将样品充分磨细。
将汁液转移到100mL容量瓶中。
残渣再加15mL2%草酸，继续研磨，汁液再合并到上述容量瓶中。
如此反复研磨2～3次，合并汁液。
最后用2%草酸定容至V=100mL，摇匀备用。
2.样品的测定
吸取汁液20mL，放入100mL锥形瓶中，立即用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至出现粉红色在15秒内不消失为止。
记录所用滴定液体积。
平行操作三次得V1=
mL，V2=
mL，V3=
mL，取平均值V=
mL。
3.空白测定
取2%的草酸液20mL，放入另一100mL锥形瓶内，用2,6-二氯酚靛酚滴定至终点，记录染料用量V0。
计算你所取生物材料中Vc的含量（单位用mg/100g鲜重）。
七.附注
2,6-二氯酚靛酚钠溶液的标定：
准确称取Vc20mg，用2%草酸溶解定容至1000mL。
吸取稀释液20mL，放入100mL锥形瓶中,立即用所要标定的2,6-二氯酚靛酚滴定至粉红色出现15秒不消失为止，记录所用毫升数，按下式计算K值（即1mL染料所能氧化抗坏血酸的毫克数）。
式中G：
称取Vc的毫克数
V：
滴定20mL标准Vc时所用染料液的毫升数与滴定空白所用毫升数之差值。
1.操作要尽可能快，并防止与铁铜器具接触，以减少维生素C的氧化。
2.草酸及样品的提取液避免日光直射。
3.当样液本身带色时，测定前于提取液中加2～3mL二氯乙烷。
在滴定过程中当二氯乙烷由无色变为粉红色时，即达终点。
八.思考题
用滴定法测定生物材料中Vc的含量有什么优缺特点?
掌握间隔法测定过氧化物酶活力的原理及操作方法
过氧化物酶（peroxidase，POD，EC1.11.1.7）是以铁卟啉为辅基的氧化酶，催化H2O2氧化某些酚类、芳香胺和抗坏血酸等还原性物质。
它广泛分布于生物界，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，如清除细胞内的有害物质H2O2、保护酶蛋白以及促进植物细胞木质素的形成等。
本实验以愈创木酚（邻甲氧基苯酚）和H2O2为底物，过氧化物酶催化H2O2放出新生态氧，使无色的愈创木酚氧化成红棕色的四邻甲氧基连酚，反应式如下：
过氧化物酶活力的大小在一定范围内与产物颜色的深浅呈线性关系，该产物在460nm有最大的光吸收，故可通过测定A460的变化来测定过氧化物酶的活力。
这里规定，一个过氧化物酶活力单位为在室温、pH5.4的条件下，酶反应体系中每分钟A460的增加值为1所需的酶量。
活力测定时，酶反应在分光光度计的比色杯内进行，由于酶反应产物增加而使A460增加，通过定时间隔记录可获得一组A460值。
以时间为横坐标，A460值为纵坐标进行线性作图（或用统计方法求得回归方程），进而计算A460的变化速率（DA460·
min-1），最后计算每克鲜重样品中过氧化物酶活力的大小。
1.材料
禾本科植物叶片
2.仪器
电子天平
高速冷冻离心机
冰浴
3.器材
微量进样器：
200ml
1000ml
7mL×
1（带盖）
硫酸纸
研钵、剪刀、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：
1.酶提取缓冲液
50mmol/L、pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，内含5mmol/L亚硫酸氢钠和1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（临用前加）。
2.酶活力测定缓冲液
0.1mol/L、pH5.4醋酸-醋酸钠缓冲液
3.愈创木酚溶液（0.25%W/V）（溶于50%乙醇中）（临用前配制）
4.H2O2溶液（0.75%）（临用前配制）
1.酶液的制备
称取0.5g左右叶片，记下实际质量
g。
将样品剪碎于研钵中，加入预冷的酶提取缓冲液5mL，置冰浴上充分研磨。
（3）离心：
匀浆液全部转入塑料离心管，于4℃下、以10,000g离心15min。
上清液全部倒入试管，此上清液即为粗酶液，待测。
2.酶活力测定
（1）将分光光度计预热10min，波长定于460nm处。
（2）在玻璃比色杯内，先加入2mL醋酸-醋酸钠缓冲液和1mL0.25%愈创木酚溶液，
再加入0.05mL或0.1mL酶液（视酶活力大小而定），最后加入0.1mL0.75%H2O2溶液，用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀。
（3）立即把比色杯插入比色架，关盖。
迅速把A460调至0并开始记时，每隔30秒读取并记录A460值，共读3分钟。
（注：
酶液加入量一般控制在5min内使A460达到0.5～0.8为宜）
1.以时间为横坐标，A460值为纵坐标，对所得数据进行线性作图（或用统计方法求
回归方程）；
2.求出上图中所作直线（或回归方程）的斜率，即ΔA460·
min-1，此为反应的初速
度；
3.求出每克鲜重植物样品中过氧化物酶的活力单位，
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