用正交法测定几种因素对酶活力的影响实验报告文档格式.docx
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三、实验原理
酶促反应常常同时受到多种因素（包括激活剂和抑制剂等）的交互影响，可采用正交法进行综合研究，即通过少量试验收到更好的效果：
多快好省。
本实验以正交法同时测定[S]、[E]、温度和pH值对trypsin活性的影响，以求得酶活最大时相应影响因素的最佳值（水平），并借此初步掌握正交法的使用。
四、实验器材和试剂
实验器材：
①试管
②漏斗
③温度计
④吸管
⑤恒温水浴锅
⑥分光光度计
实验试剂：
①2%血红蛋白液（Hb）
②15%三氯醋酸液（TCA）
③trypsin酶液
④0.04mol/L巴比妥缓冲
液（pH7,8,9）
⑤考马斯亮蓝染液
五、实验操作
1.实验设计
本实验为四因素三水平（总试验次数34=81），可选用L9正交表（仅需9次试验），展开后其特性为均衡搭配
（1）每列中水平数1、2、3出现次数相同，均为3次；
（2）每两列的横行数对（1-1/1-2/…/3-2/3-3）各出现一次。
列号
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
2.将各因素及其相应水平参数依次填入得到实验安排表
试验号
试剂/ml
2%血红蛋白液
0.2
0.5
0.8
缓冲溶液
pH7
2.6
pH8
1.7
pH9
2.3
2.0
37℃预温5min
50℃预温5min
60℃预温5min
酶液
37℃反应10min
50℃反应10min
60℃反应10min
（1）各试管编号，分别加入对应容量的底物（2%Hb）和相应pH值的缓冲液，混匀；
（2）同温处理的3支试管同时预温5min；
（3）各试管依序分别加入对应容量的trypsin酶液（统一加样时间间隔），混匀；
（4）同温处理的3支试管置对应恒温水浴中反应10min；
（5）各试管依次加入15%三氯醋酸液2ml，混匀以终止反应；
（6）非酶促对照：
另取一试管，先加入2%血红蛋白液0.5ml及pH8缓冲液2.0ml，再加15%三氯醋酸液2.0ml，混匀静置10min后再加入酶液0.5ml；
（7）上述各管反应液室温静置15min后过滤，取滤液待测酶活；
（8）酶活测定（考马斯亮蓝法，标准曲线制备略）：
取试管若干支编号，分别加入对应的样品滤液1.0ml及考马斯亮蓝液4.0ml，混匀，室温静置3min，以非酶促对照管为空白，于波长595nm比色测定。
3.数据记录及分析
将各管测定所得光密度值对应填入表格，分别算出各因素一、二及三水平的试验结果总和Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，并分别取其平均值计算相应的极差（各列中最大与最小值之差）；
比较各因素极差的大小以评估各因素对酶活的影响，并对酶活最高时的各因素水平作一直观分析。
六、实验结果及数据处理
1.实验数据：
pH值
温度
测量值
平均值
37℃
0.003
0.0023
0.068
0.0667
0.185
0.1840
0.002
0.066
0.182
50℃
0.059
0.0560
0.096
0.0967
0.079
0.0810
0.058
0.097
0.082
0.051
60℃
0.140
0.1417
0.163
0.1610
0.065
0.0660
0.141
0.159
0.064
0.144
0.161
0.069
2.实验数据处理分析：
[S]/ml
[E]/ml
温度/（℃）
pH
试验结果
10.2
20.5
30.8
137
250
360
17
28
39
Ⅰ（一水平试验结果总和）
Ⅱ（二水平试验结果总和）
Ⅲ（三水平试验结果总和）
0.2000
0.9247
0.3310
0.1650
0.4010
0.2894
0.2530
0.2337
0.3687
0.2443
0.1887
0.4224
Ⅰ/3
Ⅱ/3
Ⅲ/3
0.3082
0.1103
0.0550
0.1337
0.0965
0.0843
0.0779
0.1229
0.0814
0.0629
0.1408
极差
0.2415
0.0787
0.0450
由上述表格各因素极差大小可看出，底物浓度对于酶活力影响最大，其次是酶浓度，再次是pH，最后是温度。
根据上表数据，以吸光度值（Ⅰ/3、Ⅱ/3、Ⅲ/3）为纵坐标，因素的水平数为横坐标作图
图一底物浓度对酶活力的影响
从图一可看出，在一定浓度范围内，随着底物浓度的增大，酶活力是逐渐降低的，约在底物浓度为0.5mol/ml时酶活力达到最低。
图二酶浓度对酶活力的影响
从图二可看出，在一定浓度范围内，随着酶浓度升高，酶活力是逐渐降低的，约在酶浓度为0.55mol/ml时酶活力达到最低。
图三温度对酶活力的影响
从图三可看出，在一定浓度范围内，随着温度升高，反应速率是逐渐升高的，即酶活力是逐渐升高的，约在温度为50℃时酶活力达到最高。
图四pH对酶活力的影响
从图四可看出，在一定浓度范围内，随着pH升高，反应速率是逐渐升高的，即酶活力是逐渐升高的，约在pH为8时酶活力达到最高。
七、实验注意事项
1.每加入一种试剂都需要充分混匀。
2.应确保酶促反应的温度及反应时间的准确性。
八、思考题
1.正交法有何优点？
答：
通过少数的实验次数找到较好的生产条件，能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。
2.各管温育后为何要加入三氯醋酸液？
三氯醋酸液可作为蛋白质沉淀剂，使反应停止，进而保证变量的统一。
3.非酶促空白对照的作用是什么？
其处理为何与其他各管不同？
非酶促空白对照的作用是为了保证实验变量的统一。
因为其理论上讲并不会发生任何反应，因此不需经过加热，剩下其余条件都要和实验组相一致。
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