MALDITOFMS分析小分子化合物新方法.docx

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MALDITOFMS分析小分子化合物新方法

MALDI-TOFMS分析小分子化合物新方法

对于分子量小于400Da的化合物,使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）的常规方法难以检测，这主要是由于小分子基质带来的干扰。

为此，本方法发展了一种MALDI-TOFMS分析小分子的新策略，将小分子转移到高质量区域测定，成功的分析了赤霉酸等一系列小分子化合物。

1实验部分

Bruker公司AUTOFLEXIIIMALDI-TOF质谱仪，氮分子激光，波长355nm，使用前用混合多肽（购自Bruker公司,包括：

血管紧张肽I,血管紧张肽II,P物质,蛙皮素,促肾上腺皮质激素1-17,促肾上腺皮质激素18-39,生长激素释放抑制激素28）外标法校正仪器。

金属酞箐化合物的合成参照已发表的文献，最终产物经过紫外可见吸收光谱（UV-Vis），质谱（MALDI-TOFMS）以及核磁（NMR）表征。

样品和基质分别溶于适当溶剂，二者按照一定比例混合均匀，取1μl混合溶液滴在MALDI样品靶上，或者直接吸取1μl样品溶液滴在靶上，待溶剂自然挥发样品结晶后，送入质谱仪，进行质谱分析。

实验中数据采集时所用参数如下：

加速电压19kV，反射模式，激光频率10Hz，使用最大激光能量的40-90%，累加30-200次。

使用Bruker公司的XMASS软件，flexControl和flexAnaysis软件进行数据采集和数据处理。

2结果与讨论

2.1金属酞箐基质的发现

酞箐化合物是一类具有π电子共轭结构的大环化合物，具有良好的热稳定性和化学稳定性一直被广泛用作染料，此外，由于其独特的光、电、磁及对某些气体的敏感性等方面的特性而被应用于化学传感器、非线性光学材料、光盘信息记录材料、太阳能电池材料、燃料电池中的电催化材料、场效应晶体管、气体检测及光动力学治疗癌症等许多方面。

在用MALDI-TOFMS分析金属酞箐类化合物时，由于该类化合物在紫外可见区有吸收，可以吸收激光（波长337nm）能量，所以，在没有基质的情况下能够解吸电离得到分子离子峰。

当使用常规基质，如α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）和2,5-二羟基苯甲酸（DHB）时，三价金属酞箐化合物对基质分子有加合作用，而二价和四价金属酞箐化合物与基质分子没有加合作用。

因此，利用三价金属酞箐化合物用于分析小分子，它可以将小分子从低质量区域转移到不受干扰的高质量区域，从而消除传统基质带来的干扰。

2.2无基质时MALDI-TOFMS分析金属酞箐化合物

编号

M

R

缩写

准确质量

摩尔分子量

1

Al3+

（aPc）

[Al（aPc）]+

827.3608

827.9269

2

Ga3+

[Ga（aPc）]+

869.3048

870.6683

3

In3+

[In（aPc）]+

915.2831

915.7633

4

Al3+

（pPc）

[Al（pPc）]+

1131.4860

1132.3107

5

Ga3+

[Ga（pPc）]+

1173.4300

1175.0522

6

In3+

[In（pPc）]+

1219.4083

1220.1472

7

Mg2+

（hPc）

[Mg（hPc）]

968.2193

969.2070

8

Zn2+

[Zn（hPc）]

1008.1634

1010.3120

9

SnO

Non

（Pc）

[SnO（Pc）]

648.0469

647.2324

10

SnF2

[SnF2（Pc）]

670.0488

669.2299

11

TiO

[TiO（Pc）]

576.0926

576.3894

图1金属酞箐化合物（MPcs）的结构

（B）

（A）

（D）

（C）

图2紫外-可见吸收光谱（A）金属酞箐化合物2（B）金属酞箐化合物7

（C）基质CHCA（D）基质DHB

金属酞箐化合物（结构见图1所示）有Q带和B带两个吸收带，这是π-π*跃迁引起的。

MALDI-TOFMS所用激光波长为337nm，此波长刚好位于金属酞箐化合物B带吸收带内，图2A是酞箐化合物2在200-500nm波段的紫外可见吸收光谱，它在324nm处有较高的吸收；图2B是酞箐化合物7在此波段的吸收光谱，它在340nm处有较高的吸收。

MALDI-TOFMS所用的基质CHCA和DHB能够吸收激光能量，其紫外可见吸收光谱见图2C和D。

金属酞箐化合物的吸收峰和两个基质的吸收有很大相似之处，不同的是前者的吸收峰比较宽而后者较窄，吸收峰值不完全相同，CHCA和DHB的吸收峰值分别是340nm和339nm，更接近激光波长。

金属酞箐化合物能吸收激光能量，理论上在不加基质的情况下它能直接解吸电离产生分子离子峰。

图3为不加基质情况下酞箐化合物2的质谱图及实验所得同位素分布与理论同位素分布的对比。

从对比中看到，二者十分吻合。

（A）

（B）

图3无基质情况下酞箐化合物2的质谱图（A）及理论与实际

同位素分布的对比（B）

2.3使用常规基质时MALDI-TOFMS分析金属酞箐化合物

表2使用CHCA和DHB为基质分析金属酞箐化合物的MALDI结果

基质

编号

Masscal.

Massdet.

CHCA

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

827.4

869.3

915.3

1131.5

1173.4

1219.4

968.2

1008.2

648.0

670.0

576.1

1016.5

1058.4

1104.4

1320.6

1362.5

1408.5

968.2

1008.2

648.0

670.0

576.1

DHB

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

827.4

869.3

915.3

1131.5

1173.4

1219.4

968.2

1008.2

648.0

670.0

576.1

981.5

1023.4

1069.4

1285.6

1327.5

1373.5

968.2

1008.2

648.0

670.0

576.1

（B）

（A）

图4以CHCA为基质时（A）金属酞箐化合物2的质谱图以及

（B）实际与理论同位素分布的对比

使用CHCA和DHB作为基质，用MALDI-TOFMS对一系列金属酞箐化合物进行分析，所得质谱结果见表2。

其中，三价金属酞箐化合物1-6，检测得到的分子量比理论计算值大。

以化合物2为例，当以CHCA为基质时（其质谱图见图4A），检测得到的质荷比（m/z）为1058.4，而理论值为869.3。

用检测值减去理论计算值得到的值是189.1，相当于CHCA的分子量。

经过计算发现，其余五个化合物也是这种情况。

因此认为，化合物1-6在检测的过程中与CHCA的分子发生了加合作用，且二者比例是1:

1。

用XMASS对化合物2与CHCA加合物[M+CHCA]+的同位素进行模拟，与实验得到的同位素分布相比较（见图4B），二者吻合得很好。

实际上化合物1-6是酞箐阳离子，带一个正电荷M+，当它与中性的CHCA分子结合后形成[M+CHCA]+带一个正电荷。

而当以DHB为基质时，化合物1-6与DHB的分子发生了加合作用，二者的比例是1:

1。

从表2中，还可以看到，对于金属酞箐化合物7-11，包括二价金属酞箐和四价金属酞箐，检测得到的分子量与理论计算值相符。

基于以上的结果，可以大胆地设想：

三价金属酞箐作为MALDIMS新基质分析小分子化合物，利用它与小分子的加合作用将小分子从低质量区域转移到高质量区域，就能解决MALDI-TOFMS无法分析赤霉素等小分子样品（<400Da）的难题。

2．4金属酞箐用作MALDI基质分析小分子的新策略

从理论上讲，金属酞箐分子（结构见图1所示）具有进一步和含氧等配位原子或含大π键等分子形成络合物或加合物的潜力，它们能和小分子有机物等形成加合物，其质谱峰出现在1000Da以上的信号区域，如图5所示。

图5A表示MALDI-TOFMS正离子模式下分析柠檬酸，使用传统基质CHCA，只能在小于500Da的质量范围内产生杂乱的谱图，很难找到样品的分子离子峰，当使用铝酞箐AlPc基质，柠檬酸以加合物[Al（pPc）（citricacid）]+的形式在较高的质量范围检测到，信号强，分辨率高。

此外，还能观察到[Al（pPc）]+，可作内标或参考，用于分子量的精确测定。

AlPc基质可用于更多小分子样品的分析，见表3。

图5使用铝酞箐基质与CHCA基质的对比（A）在正离子模式下

分析柠檬酸（B）在负离子模式下分析硬脂酸

表3使用铝酞箐作基质时MALDI分析结果，使用正离子模式，分析物/基质摩尔比为5:

1

样品HA

分子式

M[Al（pPc）•HA][a]

MHA[b]

M’HA[c]

误差/ppm

α-cyano-4-hydroxycinnmaicacid

C10H7NO3

1320.5295

189.0435

189.0426

5

2,5-dihydroxybenzoicacid

C7H6O4

1285.5131

154.0271

154.0266

3

salicylicacid

C7H6O3

1269.5170

138.0310

138.0317

-5

citricacid

C6H8O7

1323.5132

192.0272

192.0270

1

gibberellicacid

C19H22O6

1477.6291

346.1431

346.1416

4

1,2,3,4-tetrahydro-9-

acridano-ne

C13H13NO

1330.5847

199.0987

199.0997

-5

[a]M[Al（pPc）•HA]=massof[Al（pPc）•HA]+.

[b]MHA=M[Al（pPc）•HA]-M[Al（pPc）]=M[Al（pPc）•HA]-1131.4860.

[c]M’HA=theoreticalmassofHA.

在负离子模式下（图5B），使用传统基质CHCA分析硬脂酸，能看到很强的与基质相关的离子：

188.0（[M-H]-），399.1（[2M-2H+Na]-），但是，使用铝酞箐AlPc基质，硬脂酸以[Al（pPc）（stearicacid-H）]-离子的形式检测到。

此时也能观察到[Al（pPc）]－，但是信号很弱。

该方法能用于分析赤霉酸（GA3），还可以分析氨基酸、小肽、脂肪酸、黄酮等小分子样品，见表4

表4使用铝酞箐作基质时MALDI分析结果，使用负离子模式，分析物/基质摩尔比为5:

1

样品HA

分子式

M[Al（pPc）•A][a]

MHA[b]

M’HA[c]

α-cyano-4-hydroxycinnmaicacid

C10H7NO3

1319.5

189.0

189.0

2,5-dihydroxybenzoicacid

C7H6O

1284.5

154.0

154.0

salicylicacid

C7H6O3

1268.5

138.0

138.0

citricacid

C6H8O7

1322.5

192.0

192.0

VitaminC

C6H8O6

1306.5

176.0

176.0

Vitaminpp

C6H5NO2

1253.5

123.0

123.0

gibberellicacid

C19H22O6

1476.6

346.1

346.1

cholicacid

C24H40O5

1538.8

408.3

408.3

Phe

C9H11NO2

1295.6

165.1

165.1

Lys

C6H14N2O2

1276.6

146.1

146.1

Cys

C3H7NO2S

1251.5

121.0

121.0

Phe-Phe

C18H20N2O3

1442.6

312.1

312.1

Asp-Phe

C13H16N2O5

1410.6

280.1

280.1

luteolin

C15H10O6

1416.5

286.0

286.0

quercetin

C15H10O7

1432.5

302.0

302.0

palmiticacid

C16H32O2

1386.7

256.2

256.2

stearicacid

C18H36O2

1414.8

284.3

284.3

样品HA

分子式

M[Al（pPc）•A][a]

MHA[b]

M’HA[c]

4,4'-（3,6-diethynyl-9H-fluorene-9,9-diyl）

diphenol

C29H18O2

1528.6

398.1

398.1

4-tert-butylphenol

C10H14O

1280.6

150.1

150.1

2-methyl-1,3,4,10-trtrahydro-9（2H）-acridinone

C14H15NO

1343.6

213.1

213.1

1,2,3,4-tetrahydro-9-acridanone

C13H13NO

1329.6

199.1

199.1

norharmane

C11H8N2

1298.6

168.1

168.1

[a]M[Al（pPc）•A]=massof[Al（pPc）•A]-.

[b]MHA=M[Al（pPc）•A]-M[Al（pPc）]+MH=M[Al（pPc）•A]-1131.5+1.0=M[Al（pPc）•A]-1130.5.

[c]M’HA=theoreticalmassofHA.

2.5样品分子量的计算

在新方法中，所看到的质谱峰不是样品本身的分子离子峰，而是加合物的峰,样品的分子量只要简单的计算就能得到。

正离子模式下（图5A）,样品的分子量为：

[M（Pc）•HA]+-[M（Pc）]+。

在负离子模式下（图5B），样品以[M（Pc）•A]-形式出现，这时的样品分子量应该等于[M（Pc）•A]--[M（Pc）]-+[H]。

2.6影响灵敏度的重要因素

在这种方法中，样品与基质的比例、M（Pc）的取代基和中心离子以及样品pKa会影响加合物的形成，进而影响质谱信号强度。

基质与样品发生加合作用，因此二者的摩尔比范围比较窄，通常为10:

1-1:

10，当大于10:

1的时候，正离子模式下金属酞箐化合物[MPc]+本身的峰强度太高，就很难检测到络合物的峰；当小于1:

10的时候，大量的样品结晶会妨碍激光能量的有效吸收和目标络合物的解吸和电离。

图6使用M（pPc）和M（aPc）做基质分析水杨酸和柠檬酸的结果比较，峰高使用h/NP均一化（h:

测得的峰高，N:

累加次数，P:

激光强度）

酞箐环上的取代基也会影响质谱信号强度，从图6可以看到，芳香取代的金属酞箐M（pPc）比烷基取代的金属酞箐M（aPc）产生信号强。

相对于取代基而言，酞箐的中心金属离子对质谱信号有更大的影响。

Sn4+、Ti4+等高价金属离子或Zn2+、Mg2+等较低价金属离子，都不能产生理想的质谱信号，只有第三主族的Al3+、Ga3+、In3+等离子才能产生较好的加合物信号。

从信号强度看（图6），它们的优选顺序是Al3+>>Ga3+>In3+，这和它们形成络合物的能力相一致。

因为Al、Ga、In的价电子结构分别为3s23p1、3d104s24p1、4d105s25p1，轨道杂化以后可以形成3、4、6配位化合物。

事实上，它们可能与酞箐环的四个配位氮原子形成了四面体配位结构，当与有配位能力的小分子样品相遇时，可能会全部或部分转变成八面体配位结构（图7所示），从而出现了观测到的质谱峰。

图7A表示的是金属酞箐和样品分子之间可能发生的反应。

图7B表示的是八面体配位[MPc•A•HA]结构和最可能的离子化路线。

图7（A）金属酞箐和样品分子之间可能发生的反应；（B）八面体配位[MPc•A•HA]最可能的离子化路线

图8混合物样品的MALDI谱图使用铝酞箐作基质（A）正离子模式下（B）负离子模式下，各个峰对应：

（a）水杨酸（pKa=2.97）（b）4-叔丁基苯酚（pKa=10.39）（c）咔啉（pKa=14.9）（d）棕榈酸（pKa=9.7）（e）硬脂酸（pKa=10.15）（f）吲哚（pKa=16.2,未检测到）

除了基质本身，样品的pKa值也会影响质谱信号。

检测了六种不同pKa的等摩尔的混合物，结果见图8，谱图没有吲哚的目标离子峰，说明它可能没有与基质发生加合作用。

从图中可以看到，目标信号随着样品酸性的增强（pKa值减小）而增强，这表明在基质－样品络合物形成中，静电作用很重要。

由于质谱信号强度受到上述很多因素的影响，新方法的灵敏度也会随基质与样品的不同而有所变化，使用铝酞箐基质Al（pPc）分析CHCA（pKa=1.2）的检测限为17fmol。