生物科技行业分子生物学检验技术实验指导文档格式.docx

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【实验器材和试剂】

1、动物

小白鼠

2、设备

移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；

751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。

3、试剂

（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技X公司）：

包括BufferCL、BufferPP、BufferGE、RNaseA、ProteinaseK

（7）生理盐水，4℃贮存

（8）无水乙醇、70%乙醇

【操作步骤】

1、制备肝匀浆

迅速处死小白鼠，称取新鲜肝脏组织50mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300μlBufferCL。

将肝匀浆液放入EP管，加入1.5μl蛋白酶K，漩涡震荡10s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。

2、提取DNA

（1）加入1.5μlRNaseA，颠倒混匀，37℃孵育15-60min。

（2）冰上孵育1分钟使样品迅速冷却。

（3）加入1/3体积的BufferPP，涡旋震荡20s，12000rpm离心3min。

（4）将上清转移到—个新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见絮状沉淀（纤维状DNA）从溶液中析出。

12000rpm离心1min，弃上清。

（5）加入300μl70％乙醇，颠倒数次以洗涤DNA沉淀。

12000rpm离心1min，弃上清，室温干燥15min。

（6）加入50μlBufferGE溶解DNA（如果DNA的量比较大，能够65℃孵育以促进DNA的溶解），室温保存待测。

3、DNA浓度和纯度的测定

取0.1mlDNA样品，加蒸馏水至1ml，在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。

计算：

DNA浓度（μg/ml）=A260×

50×

10（请问系数50、10是如何得来的？

）

DNA纯度=A260nm/A280nm

【注意事项】

（1）由于DNA主要存在于细胞核内，为便于提取DNA，肝脏的破碎要严格控制好。

即要尽可能的将细胞膜破碎，又要尽可能多保留完整的细胞核，以保留60～70％的完整细胞核为宜。

为避免DNA过度断裂，不宜用电动研磨器制备匀浆。

在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。

（2）用氯仿除去组织蛋白，要不断振荡使蛋白质变性。

如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。

（3）酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应避免接触皮肤。

（4）室温下干燥时尽可能使残留的乙醇挥发掉（DNA中残留的乙醇会影响内切酶的活性或电泳时DNA不下沉），但不要让DNA完全干燥，否则极难溶解，DNA溶解过程通常需要12-24hr。

（5）提取过程应尽量保持低温。

（6）在波长260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50μg/ml；

单链DNA或RNA为40μg/ml；

单链寡核苷酸为20μg/ml。

据此来计算核酸样品的浓度。

紫外分光光度法只用于测定浓度>

0.25μg/ml的核酸溶液。

（7）A260nm/A280nm比值应介于1.8~2.0之间，若比值>

2表示DNA样品中含有较多的RNA，如比值<

1.8表明样品中有蛋白质污染。

应根据后续实验要求，采取不同的方法纯化。

当然也会出现DNA溶液中既含蛋白质又含RNA，其比值介于1.8~2.0的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。

【结果】

1、A260=，A280=。

2、小鼠肝组织中DNA浓度是μg/ml。

3、小鼠肝组织中DNA的A260nm/A280nm比值是。

【思考题】

1、提取和纯化的真核组织DNA有何用途？

2、你的A260nm/A280nm比值结果是否介于1.8~2.0之间？

有何意义？

3、请结合你的实验结果和操作步骤，分析如何检测和保证DNA的质量？

实验二聚合酶链反应

采用聚合酶链式反应技术扩增小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）用于体外扩增位于俩段已知序列之间的DNA区段（靶序列）。

其原理是通过耐热DNA聚合酶催化的DNA合成反应达到对靶序列的扩增。

反应中使用俩条化学合成的寡核苷酸作为引物，分别和模板DNA俩条单链互补，待扩增序列片段位于俩条引物之问。

PCR扩增包括3个步骤，即变性、退火和延伸。

反应需要模板、引物、DNA聚合酶和脱氧核糖三磷酸（dNTP）等的参和。

反应混合液被加热以使模板DNA双链变性成为二条单链，随后将反应混合液冷却至引物的熔点温度（Tm）以下，使引物能和靶序列形成杂交双链（退火）。

当温度升至72℃左右时，反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以碱基互补方式依次把dNTP加至引物的3’端，使互补链从5‘向3’方向不断延伸，直至形成新的DNA双链。

通过变性、退火和延伸的壹个循环能够使靶序列的分子拷贝数增加壹倍。

由于每次扩增的产物又作为下壹次扩增的模板，因此反应产物的量以指数形式增长，壹个分子的模板经过n个循环可得2n个分子拷贝产物。

本实验扩增的是小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因，扩增产物片段大小为541bp。

扩增所用的上游引物序列为：

5’-AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG-3’，下游引物序列为：

5’-GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3’。

1、设备

PCR仪、0.2mlPCR反应管、1.5ml离心管、移液器、吸嘴、旋涡混合器。

2、试剂（20μl体系）

PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技X公司）

1、分别在PCR反应管中加入2×

PCRmix10μl、上游和下游引物各2μl、DNA2μl和H2O4μl。

2、把PCR反应管放人PCR仪，按仪器操作要求启动扩增程序。

本实验的扩增程序为：

94℃预变性5分钟后进入循环扩增，即94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min。

重复35个循环后，于72℃再延伸10min，最后4℃保温。

3、反应结束后，将PCR反应管于12000rpm离心15s，取扩增产物进行电泳分析。

1、由于PCR技术的灵敏度高，极微量的污染也会造成扩增的假阳性结果。

因此，必须采取相应措施避免发生污染。

2、PCR实验应设立阴性对照反应，即在反应体系中不加模板DNA。

3、多份样品同时扩增时，可配制总的反应混合液，且分装于PCR管中，然后再在各管中分别加入模板。

4、临床诊断用PCR反应必须在专门的PCR实验室中进行，实验室应包括试剂配制室、模板制备室、PCR扩增室和产物检测室等功能区。

PCR实验中的各个步骤应在相应的功能区中进行。

5、PCR试剂和模板DNA及样品应分别保存于不同功能区的冰箱中。

6、操作时应戴手套，配制反应体系和加模板时应分别使用专用的移液器，所有耗材使用前必须经高压灭菌，用后按规定处理且丢弃在指定容器中。

1、PCR各组分在反应中的作用是什么？

2、降低退火温度、延长变性时间会对反应有何影响？

实验三琼脂糖凝胶电泳

掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。

电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。

琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用技术。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不壹样，可进行分离。

凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也能够分离相对分子质量相同，及构型不同的DNA分子。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。

荧光染料溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中形成复合物，紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量。

由于EB是致癌剂，当下开发出了安全的染料，如SyberGreen、GelRed、GoldView等。

【仪器和试剂】

1.仪器

天平、锥形瓶、微波炉（或电炉）、制胶板、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析仪（或紫外线透射仪）、微量可调移液器、移液管、量筒、壹次性塑料手套。

2.试剂

（1）50×

TAE电泳缓冲液：

Tris碱242.0g、冰乙酸57.1ml、EDTA63.5g、NaOH10.0g，加蒸馏水至1000ml，使用前用蒸馏水稀释至1×

TAE电泳缓冲液。

（2）6×

loadingbuffer：

（0.25％溴酚蓝，0.25%二甲苯氰FF，30%甘油水溶液）或（0.25％溴酚蓝，40％（w/v）蔗糖水溶液），贮存于4℃。

（3）电泳级琼脂糖（Agarose）、溴化乙锭（母液:

将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可）、DNAMarker、DNA、蒸馏水。

【实验步骤】

1．配制1.5％的琼脂糖凝胶：

精确称取1.5g电泳级琼脂糖，加入100ml1×

TAE电泳缓冲液，在微波炉里（或电炉）加热使琼脂糖颗粒完全溶解（加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发），待胶冷却至55º

C左右时，加入20µ

l溴化乙锭（也可先不加EB，而是电泳后再用0.5µ

g/ml的EB溶液浸泡染色），轻轻旋转混匀。

插入合适的梳子，将溶液倒入制胶板中，待凝结后拔去梳子待用。

2.加样：

将凝胶置于电泳槽，加入1×

TAE电泳缓冲液覆盖胶面即可。

各取PCR产物和DNA分子量参照物10µ

lDNA加入1µ

l6×

loadingbuffer，混合后上样，分别加入琼脂糖凝胶孔内。

加样时切勿破坏点样孔周围的凝胶。

3.电泳：

合上电泳槽盖，打开电泳仪，控制电压保持在60-80V，电流在40mA之上。

当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。

4.染色：

未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室温下染色20-25分钟。

5.观察和拍照：

电泳完成后切断电源，取出凝胶，置于凝胶成像分析仪上观察电泳结果，且照相记录。

或在波长为254nm的紫外灯下观察DNA的荧光条带。

紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。

1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：

（1）DNA大小：

迁移速率和logN成反比（N为碱基对数目）。

分子越大，迁移越慢。

分子量相同的空间结构越紧密的电泳越快，如超螺旋>

线性DNA。

（2）琼脂糖凝胶浓度：

不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA：

琼脂糖凝胶浓度

可分辨的线性DNA片段大小（kb）

0.5%

5－60

0.7%

0.8－12

1.0%

0.4－6

1.5%

0.2－4

1.75%

0.2－3

2.0％

0.1－3

（3）DNA构象：

壹般迁移速率超螺旋环状>

线状DNA>

单链开环。

当条件变化时，情况会相反，仍和琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

（4）所加电压：

低电压时，线状DNA片段的迁移速率和所加电压成正比。

使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃。

（5）嵌入染料的存在：

降低线性DNA迁移率（不提倡加在电泳液中）。

（6）电泳缓冲液（0.5×

TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率。

无离子存在时，核酸基本不泳动；

离子强度过大产热厉害，熔化凝胶且导致DNA变性。

壹般采用1×

TAE，1×

TBE，1×

TPE（均含EDTApH8.0）。

2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染，凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

3．电泳指示剂：

核酸电泳常用的指示剂有俩种，溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；

二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

【实验结果和分析】

1．电泳过程中，你自己或本组所采用的电压为________伏特（v），电流为_______毫安（mA），通电时间为_______分钟。

2．在实验报告上描画自己或实验组的电泳图谱，标明阳极和阴极位置。

你的电泳结果如何？

成功或失败有哪些方面的原因？

进行琼脂糖凝胶电泳时应注意哪些问题？