侦测食品中之微生物Word格式.docx

侦测食品中之微生物Word格式.docx

《侦测食品中之微生物Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《侦测食品中之微生物Word格式.docx（26页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

9-1

標準平板法〔StandardPlateCount（SPC）〕，活菌數

1.計數：

25~250cfu（或30~300cfu）

2.假設：

（1）各培養皿中之菌落源自單一菌體。

（2）所提供之條件（營養、溫度等）足以使食物中所有菌生長，而產生菌落。

3.方法：

（1）混稀法（pourplatecount）

（2）塗抹法（spreadplatecount,surfaceplatecount）

塗抹法優缺點（與混稀法比較）

（a）無熱傷害

（b）有利好氧菌快速生長

（c）容易計數

（d）可自動化操作

（e）菌落易分離

螺旋平板法（Spiralplatecount）

1.所用培養基、平板、稀釋液、吸管均較少

2.快速，50~60plate/h

3.易受食物顆粒阻塞

5.設備費用高

9-2

膜濾法（Membranefiltrationmethods）

●適用於水、飲料、或空氣等菌數低者

●可能需預濾，以去除食物顆粒，或添加酵素、介面活性劑等以利過濾

1.直接螢光過濾法（DirectEpifluorescentFilterTechnique，DEFT）

留於濾膜上之菌株，以螢光染劑，如acridineorange染色，再以螢光顯微鏡計數

操作：

Foodhomogenate

↓

5μmnylonfilter

↓

filtrate,＋2mlTritonX-100&

0.5mlTrypsin

0.6μmNucleoporepolycarbonatefilter

filterstainedwithacrineorange

count

2.Microcolony-DEFT

●

Filtration

Microcolonymethod：

Sample→filter→plate,incubatefor3~6h→microscopiccount

●Microcolony-DEFTmethod：

（nucleoporemembrane）

Sample→filter→plate,andincubated→acridineorangestain→fluorescencemicroscopiccount

9-3

3.疏水性格膜過濾法（HydrophobicGridMembraneFiltration,HGMF）

（1）1600waxgrid/membrane

（2）減少稀釋操作

（3）已有分析項目

totalcoliforms

fecalcoliforms

Salmonellae

E.coliO157:

H7

顯微鏡菌落計數（Microscopecolonycounts）

0.1mlsample＋2mlnutrientagar→mix→spreadovera4cm2areaonaglassslide→incubated3~8hinawarmmoistchamber→airdried,flame-fixed,stainforcountwithmicroscope.

Petrifilm

1.將培養基塗敷於數層纖維所構成之薄膜上

2.攜帶儲存方便

3.可用於表面微生物分析

最可能菌數法〔MostProbableNumber（MPN）〕，活菌數

1.3-tubeor5-tube

2.atleast3seriousdilutionsareused

3.monitoredbyturbidity,colorchange,orgasproduction

4.estimateddata,lessprecisethanagarplatingmethods

5.usedforlowcellcounts

9-4

染劑還原法（DyeReductionTests），活菌數

1.原理：

菌體具reductase，當菌體代謝時，故使培養液還原所需時間與菌數成反比。

2.還原指示劑：

methyleneblue：

從藍色變成無色

resazurin：

二段式，

（1）從藍→紫→粉紅，不因O2存在而又變成藍；

（2）從粉紅變無色，可因O2存在又氧化成粉紅。

3.特性

（1）比SPC快

（2）估測值

（3）非所有MO.還原能力（速度）相同

（4）指示劑可能對部分MO.有抑制作用

（5）食品本身可能亦含還原劑或酵素而干擾

直接鏡檢〔DirectMicroscopicCounts（DMC）〕，活、死菌

1.操作

（1）取0.01ml均質液平均塗抹於1cm2面積之載玻片上

（2）固定（40-50℃）、乾燥

（3）染色

（4）油鏡下計數

2.優點

（1）快速；

（2）簡單；

（3）不需其他設備；

（4）觀看菌體形狀；

（5）樣品量極少。

9-5

3.缺點

（1）死、活不分；

（2）僅適用於高菌含量樣品；

（3）觀察者易疲勞；

（4）菌體可能成團，分散不均，或有些不易染色。

現已有方法區分死、活菌體

Ø

HowardMoldCount

1911年由B.J.Howard開發，分析蕃茄製品中黴菌，另外，機械黴Geotrichumcandidum亦相似，均利用有凹槽載玻片，在顯微鏡下，計數食品中所含黴菌菌絲，需有經驗者方能操作，且易疲勞。

表面微生物檢驗

生物體表

加工機械、器皿、工作台

1.Swab/Swab-RinseMethod

最早、最廣泛使用者

以棉花棒（濕）塗抹固定面積之物體表面，再將之放入含無菌水之試管內，均質，稀釋，平板法計數，若配合ATP分析法，塗抹後，可迅速得知結果，常用於清洗效果之評估用。

9-6

2.接觸平板法（Contactplate）

以特殊雙重皿，導入15.5-16.5ml之培養基，產生凸起洋菜培養基表面，將之覆蓋於欲測物面，加蓋培養，計數菌落數。

回收率不高，有人云僅0.1％，即若測得10cfu/cm2，實際含量為104cfu/cm2。

亦有人實驗顯示回收率低於塗抹法（Swabmethod），較適用於低污染物表面。

3.噴槍法（Spraygun）

以高壓水沖洗物體表面，再分析洗液中菌數。

對肉品表面菌數分析，此法優於塗抹法。

代謝性受傷之微生物（Metabolicallyinjuredorganisms）

微生物受次死環境侵害，影響其代謝（但未死亡），故在選擇性培養基上無法生長，但可在非選擇性培養基生長，故可將樣品分別選擇性及非選擇性培養基分析之，二者之差，即為InjuredMO.。

食品病原菌之檢測管制，常為「不得檢出」，測試樣品由於曾經凍藏、或加熱等處理，可能含有受傷之病原菌（未死），故通常需將樣品均質液放在適當非選擇性培養液中短暫時間（1~4h），使受傷菌復原，再以選擇性培養基分析之。

由部分研究顯示，培養液中含丙酮酸或催化等有助於受傷菌復原，此二物質之功能均為分解過氧化物，故推測受傷菌可能缺乏去除過氧化物之能力。

MO.代謝性傷害可能發生在細胞膜（脂質）、核醣體、DNA、或某些酵素。

9-7

不能培養的活菌（Viablebutnon-cultivableorganisms,VBNC）

VBNC與代謝傷害性菌不同，後者可於非選擇性培養基修護。

VBNC首被發現於海洋弧菌，當海水溫度被降至5℃，弧菌成為VBNC狀態。

此時，platecount者很低，但由以acridineorange之鏡檢法（可區分死、活），菌數卻非常高。

當溫度升高，VBNC即可恢復原來狀態，處於VBNC之病菌，仍具致病力，僅毒性較低。

9-8

物理、化學、分子及免疫分析法

A.物理方法

1.電阻抗或導電度法（Impedance/ConductanceMethod）

（1）原理：

微生物生長時，要利用（分解）環境中成份，因此改變環境（培養液）中電阻抗/導電度。

（2）固定儀器，有其偵測之靈敏度。

（3）儀器感應出電阻抗/導電度變化所需時間（Detectiontime）與菌體數成反比。

（4）由已知菌數樣品進行標準曲線之制訂，再用以分析未知菌數。

（5）Vitek公司之Bactometer測電阻抗；

Malthus公司則偵測導電度。

2.流電細胞計數法（flowcytometry）

原用魚動物細胞測定，現可用於酵母菌計數，若配合螢光抗體，可測特定細菌。

B.化學方法

1.Thermostablenuclease

（1）金黃葡萄球菌具coagulase及therostablenuclease，二者相關性高，故藉由食品中Thermostablenuclease活性高低，得知S.aureus多少。

然部分enterococcus亦具nuclease活性，且少部分為thernostablenuclease（4.3％）。

9-9

（2）分析thermostablenuclease以代表S.aureus生長狀況之優點：

（a）耐熱性，即使菌體因熱死亡，nuclease仍在，而S.aureus所產之腸毒素亦屬熱安定性。

（b）偵測比腸毒素快。

（c）比腸毒素早產生。

（d）不需濃縮即可偵測，腸毒素需濃縮。

（e）二者均為熱安定性。

2.Limuluslysateforendotoxins

G（－）之outermembrane之lipopolysaccharide（LPS）—endotoxin

Limuluspolyphemous之amoebocyte（血球細胞）裂解物蛋白對endotoxin極敏感（活化），使得lysate呈膠狀，早期分析法乃偵測可使lysate成gel之最大食品稀釋度（即為力價數，titer），為半定量法。

近來，發展出呈色法，加入試劑（如gly（ala）-arg-ρ-nitroalanine（ρNA），當樣品中有LPS，可使coagulase活化，其可將ρNA水解，產生ρ-nitroalanine，測405nm吸光值。

Endotoxin

FactorCFactorC*

FactorBFactorB*

ProclottingenzymeClottingenzyme

*：

活化狀態

CoagulogenCoagulin

9-10

ρNA:

ρ-nitroalanine

3.ATP測定

活細胞均有ATP且細胞內ATP含量恆定，以菌量而言，含量約10－18~10－17mole/cell，將菌體內之ATP萃取出來，分析其ATP含量，即間接代表菌數多寡。

利用螢火蟲發光機制，來分析ATP：

LH2＋E＋ATPE·

LH2－AMP＋PPi

E·

LH2－AMP＋O2E＋L＝O＋CO2＋AMP＋Light

LH2：

luciferinE：

luciferase

L＝O：

oxyluciferinPPi：

pyrophosphate

9-11

此法非常快速，可用在工廠清洗效率評估之快速偵測用。

若應用在食品上，需克服來自食品之ATP干擾，可利用離心、過濾等物理方除去食品顆粒，或添加酵素apyrase，選擇性地破壞食品ATP。

4.螢光性及發光性基質之應用

常用基質：

4-methlumbelliferyl-β-D-glucuronide（MUG）

4-methlumbelliferyl-β-D-galactoside（MUGal）

4-bromo-4-chloro-3-Indolyl-β-D-glucuronide（X-Gluc）

o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside（ONPG）

5-bromo-4-chloro-3-Indoxyl-β-D-glucuronide（BCIG）

L-alanine-P-nitroanilied（LAPN）

其中以MUG之螢光性基質最常用，其可被β-D-glucuronidase（GUD）水解，釋放出具螢光之4-methyl-umbelliferygroup，E.coli具有GUD，故可用於E.coli檢驗，將MUG加入大腸桿菌群分析用之選擇性培養基中，如lauryltryptosebroth（LTB），有E.coli者，會產生螢光，約107cell之E.coli產生之GUD才足夠偵測到MUG結果。

ONPG亦同樣利用，經β-D-galactosidase水解後，產生黃色（420nm吸光），用已偵測Coliforms。

若NPG及MUG同時當作唯一營養基質，coliforms呈黃色菌落，黃色菌落同時有螢光者為E.coli。

9-12

5.Lux基因之發光

Lux基因負責luciferase之合成，將luxgene轉殖到噬菌體，在噬菌體本身，因缺發光所需之成分，無法發光，利用噬菌體對細菌記主之專一性，其基因進入細菌後，發光。

可用以分析特定細菌（病原菌）。

C核酸探針/PCR

尋找預測微生物特有的核酸片段，將之標示，此即為核酸探針。

當此probe碰到與其互補序列，會結合（or雜交，hybridization），由probe之標示物，我們可偵測之。

典型分析法：

預測cell→抽取DNA→內切水解→電泳→轉至NCmembrane→加probe行hybridization→清洗→偵測，偵測敏感度：

104~105，若低於此，樣品先經enrichment，使少量菌增殖，再偵測之。

另外，發展菌落雜交法（colonyhybridization），乃樣品均質→選擇性培養基培養，其上菌落複製至membrane上，在加reagent，使菌溶製（lysis），使DNA露出，成單股，加probe偵測之。

近年來，伴隨PCR（polymerasechainreaction）之放大技術，使食品中存在之少數菌之DNA，在人為操控環境下進行複製。

Primer,DNApolymerase,dATP，dGTP，dCTP，dGTP

9-13

經過多次循環（20~50cycles），可使單一DNA分子擴增至107DNA分子，如此，樣品中即使僅1個cell，也可以測到。

1.核酸探針的優點和缺點

（1）核酸探針的優點：

（a）核酸探針不必單離、純化菌株，可節省不少的時間與成本。

（b）核酸探針可以快速鑑定、計數與之雜交的菌株。

（c）特異性高，其受微生物其基因突變或細胞內的控制影響較少。

（d）對於有機溶劑、鹽的容忍度而言，DNA的穩定度比蛋白質為高。

（e）靈敏度高。

（2）核酸探針的缺點：

（a）利用32P-labeled核酸探針，其t1/2=14天

（b）核酸探針不能探知食品中已經存在的毒素。

（3）核酸探針的一般特性：

（a）Targetnucleicacid的選擇（Wolcott,1991）

選擇Targetnucleicacid可由下列四方面著手：

（i）為genomicDNA，物種會含隨某些特殊的基因片段，故其特異性甚高。

（ii）為messengerRNA（mRNA），在生物體內mRNA的量比genomicDNA高出很多，所以比較容易被偵測。

（iii）為rRNA，這是最有用的核酸探針來源，它同時具有用genomicDNA和mRNA為探針的點。

最後核酸探針的來可由plasmidDNA所獲得，菌產生毒素的基因可能在plasmidDNA上，故可藉此作核酸探針。

9-14

（b）探針的大小

探針的大小可從10nucleotidebases（M.W.3,300）至10,000base（M.W.3,300,000），然而最常見的核酸探針在14至40base之間。

核酸探針可依其核酸探針的片段長度區分成短鏈探針和長鏈探針。

短鏈探針，其雜交的度比較快，但是專一性較差且很難被label上去。

（c）核酸探針的label

核酸探針label的方法計有（Veldetal.,1988）

a.radioactiveprobe

b.biotin-avidinsystem

c.mercurationofnucleicacidprobe

d.chemicalmodificationofDNAprobe

e.detectionofUV-radiatedDNAbysepificantibody

f.sulfonatedDNAprobe

D.免疫分析

利用抗體-抗原專一性結合特性，偵測細菌、毒素或其他污染物。

抗體-抗原結合之偵測：

（1）標示法

●螢光免疫分析—需螢光顯微鏡或螢光分光光度計

●放射性免疫分析—較昂貴，且有安全及半衰期問題

●酵素免疫分析—廣泛使用，有多種分析模式

9-15

（2）沈澱法

抗體有2個抗原結合位置，而抗原若為大分子者，常可與多個抗體分子結合，如此，多個抗體、抗原分子結合成大分子而不可溶，沈澱之。

免疫擴散分析即屬此。

免疫雙擴散分析（Ouchterlonytest）

（3）凝集法

將抗體（或抗原）coating在微小顆粒表面，用已偵測抗原（或抗體），當與被偵測物質結合，造成微小顆粒產生凝集現象。

所用微小顆粒，早期使用紅血球，但易破，現採用latexbead。

由於免疫分析法其靈敏度之限制（103~105），菌數太低者，需經enrichment，使菌體增殖，在加抗體分析之。

另外，抗體專一程度，為關鍵所在，否則易有交叉反應。

9-16

目前在食品系統，以EIA及Latexbead之凝集法，最廣泛被使用，而Oxoid所發展出之Salmonella1-2Test，屬於免疫沈澱分析法。

食品均質液，若含Salmonella，其可在其內生長、游動（含鞭毛），由至非選擇性培養管內，而後者加入Salmonella之鞭毛抗體，碰到Salmonella鞭毛抗原，產生沈澱帶。

9-17

9-18

9-19

9-20

9-21

HGMF

9-22

9-23

9-24

9-25

9-26

9-27

9-28

9-29