微生物遗传与分子生物学习题Word文件下载.docx
《微生物遗传与分子生物学习题Word文件下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《微生物遗传与分子生物学习题Word文件下载.docx(18页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
最终,物种的面貌特征与祖先不同,所以说,突变是生物进化的内因,是进化的主要动力。
无数事实说明了一个真理,即宇宙间的所有物种变是绝对的,不变则是相对的。
第二章第一节链霉菌遗传特性及主要研究技术手段
1、应用于链霉菌基因组编辑与大片段DNA克隆的技术都有哪些?
能否用在你们今后的实验中?
(基因组编辑是指在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。
原理是构建一个人工内切酶,在预定的基因组位置切断DNA,切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变,从而达到改造基因组的目的。
)
一、链霉菌基因组编辑技术有:
1、I-SecIendonuclease介导的同源重组系统:
敲除质粒上含有一串联的与靶片段左右臂同源的两个DNA片段以及I-SecI识别的18个碱基的位点(sceS)。
将该质粒导入链霉菌细胞,并通过抗性筛选质粒插入到基因组上的克隆。
如果发生同源单交换,该质粒将被完整导入基因组靶位点。
通过诱导表达SecI,SecI在sceS位点切断基因组DNA,菌体不能够存活。
如果发生同源双交换,sceS被删除,即使诱导表达SecI也不会造成基因组DNA的断裂,菌体仍然存活,并表现出抗性敏感。
2、CRISPR-Cas9介导的同源重组系统:
首先优化cas9的密码子,将其放置在强启动子之后并克隆到敲除质粒上。
敲除质粒上含有sgRNA并置于组成型启动子之后,sgRNA中的引导序列为靶位点的同源序列,敲除质粒必须包括靶基因两侧的同源臂。
将该质粒导入链霉菌,CRISPR/Cas9系统将靶位点切断,同时质粒上的同源臂与基因组上的同源臂发生双交换,将断裂的靶基因区删除,基因组重新连接。
(CRISPR/Cas9系统先切断靶序列后直接发生双交换,最后断裂的靶基因直接被敲除)
3、位点特异性整合酶介导的基因组编辑:
(cre/lox系统)
利用两次同源单交换分别将两个loxP位点整合到目的基因片段的上下游,再将Cre蛋白表达质粒导入链霉菌,在Cre蛋白的作用下,两个loxP位点发生位点特异性重组,完成目的基因片段的敲除。
而环化的DNA由于不能在链霉菌中复制,随着传代而丢失。
二、大片段DNA克隆的技术:
1、依赖于酵母菌的转化介导的大片段DNA重组克隆(TAR)
基于FBT1attp-attB-int整合系统的链霉菌基因组DNA大片段克隆技术:
通过接合转移将质粒pSV:
:
attB6Up导入链霉菌,卡那霉素筛选获得pSV:
attB6Up同源整合到目的位置的菌株S-attB6。
再将pKC1139:
attP6Dn导入S-attB6,在40度培养,pKC1139:
attP6Dn通过同源单交换整合到目的位置获得S-attB6P6。
通过接合转移将含有FBT1整合酶的pIJ10500导入S-attB6P6中,利用整合酶将目的基因簇环出,并克隆到载体pKC1139上。
2、CRISPR/Cas9系统介导的DNA大片段克隆:
RNA指导的Cas9在特定位点将染色体切开,在两端分别与目标片段有30bp重叠序列的质粒被连接到目标片段上。
重组质粒被电转到宿主细胞内。
在今后的实验中可能会用到:
我们实验室是分子生物学实验室,这些技术方法对于我今后的研究是有助益的。
我们平时多采用基本的遗传操作,构建敲除质粒载体,然后导入受体菌株进行同源重组进行单交换,利用抗生素进行筛选,随后还需要进行双交换。
我们可以考虑使用基因编辑技术来进行遗传操做。
比如应用CRISPR-Cas9介导的同源重组基因编辑技术来使之直接发生双交换而直接敲除靶标基因,这样操作起来并不繁琐,也省去了些过程,并且对是否发生双交换也比较好判断。
2、I-SecIendonuclease介导的同源重组系统
通过诱导表达SecI,SecI在18个碱基的位点(sceS)切断基因组DNA,菌体不能够存活;
如果发生同源双交换,sceS被删除,即使诱导表达SecI也不会造成基因组DNA的断裂,菌体仍然存活,并表现出抗性敏感。
3、位点特异性整合酶介导的基因组编辑
(1)利用两次同源单交换分别将两个loxP位点整合到目的基因片段的上下游,再将Cre蛋白表达质粒导入链霉菌,在Cre蛋白的作用下,两个loxP位点发生位点特异性重组,完成目的基因片段的敲除。
(2)基于FBT1attp-attB-int整合系统的链霉菌基因组DNA大片段克隆技术
通过结合转移将质粒pSV:
通过结合转移将含有FBT1整合酶的pIJ10500导入S-attB6P6中,利用整合酶将目的基因簇环出,并克隆到载体pKC1139上。
4、CRISPR-Cas9介导的同源重组系统
首先优化cas9的密码子,将其放置在强启动子之后并克隆到敲除质粒上,敲除质粒上含有sgRNA并置于组成型启动子之后,sgRNA中的引导序列为靶位点的同源序列,敲除质粒必须包括靶基因两侧的同源臂。
将该质粒导入链霉菌,CRISPR/Cas9系统将靶位点切断,同时质粒上的同源臂与基因组上的同源臂发生双交换,将断裂的靶基因区删除,基因阻重新连接。
(1)CRISPR/Cas9系统用于系统的代谢工程研究,可以构建随机基因敲除突变体库,进行精确的基因组编辑,以及进行精确的基因或基因簇置换。
(2)CRISPR/Cas9系统可以通过同源重组进行基因的定点突变。
(3)CRISPR/Cas9系统可用于基因调控,即Cas9与激活子或抑制子融合,从而调控被gRNA靶向的基因的表达水平。
(4)CRISPR/Cas9系统可用于对DNA大片段进行克隆。
第二章第二节链霉菌发育分化与次级代谢产物的生物合成
作为丝状细菌的链霉菌经历一个怎样的分化过程?
次级代谢产物在什么阶段产生?
链霉菌的形态分化和生理分化(次级代谢)对其自身有何意义?
作为丝状细菌链霉菌的分化过程为:
1,孢子萌发形成基质菌丝;
2,基质菌丝延伸、分枝;
(光秃表型)
3,向空气中生长形成气生菌丝;
4,气生菌丝产生螺旋和分隔;
(白表型)
5,分隔加深形成孢子链;
6,孢子链变灰,成熟;
(灰表型)
7,释放游离孢子。
链霉菌的发育分化过程中有部分的基质菌丝和未分化成为孢子的气生菌丝存在有死亡现象。
留的残体既可以作为机械支撑用于气生菌丝分化从而脱离培养基表面,同时也可作为水分和营养物质的运输通道。
基质菌丝向气生菌丝转变的过程中产生次级代谢产物。
意义:
链霉菌发育分化和次级代谢产物的合成一般都是起始于对环境中营养匮乏的感应。
形态分化
(形态分化过程)营养生长阶段,基质菌丝经过顶端生长和分支,在感受到环境中的营养限制或者其他压力后,为了应对胁迫,通过bld基因的级联信号通路产生疏水分子SapB,从而赋予菌丝表面疏水特性而使其突破培养基表面的气-水张力进入繁殖性的气生菌丝阶段;
然后在whi基因等的级联信号通路控制下产生孢子,孢子成熟后飘落到适宜的环境中再进行上述过程生活。
这种形态分化过程可以赋予链霉菌抵御环境胁迫的能力。
进行生殖生长产生气生菌丝和孢子,成熟孢子随风或其他生物被带到更加适宜其生活的环境中,对于链霉菌自身是十分重要的生活方式,使之区别于其他的原核生物。
次级代谢
(1)次级代谢产物的合成利用初级代谢的某些中间体,可避免其过量积累对机细胞产生的毒害作用。
(2)细胞死亡可为孢子的形成提供营养物质,伴随着基质菌丝向气生菌丝的转变,链霉菌通常会在这一时期产生抗生素,这对于链霉菌专一性的重新利用自身裂解产物可能具有重要的意义。
第二章第三节棒杆菌的分子遗传与代谢
1、如何通过组合生物合成获得新结构活性化合物?
1、基于改变前体物的组合生物合成
是指在前体渗入到终产物之前通过基因工程技术将其改变,然后将内源生成的修饰后前体物掺入到化合物中,形成新的化合物或其衍生物。
(1)前体定向组合生物合成:
利用NRPS或PKS的底物宽容性,通过在发酵过程中添加一些修饰后的前体物产生新型化合物或衍生物的过程。
(2)突变组合生物合成:
将某一前体的生物合成途径阻断,然后在该阻断突变株中添加前体类似物产生新型化合物或衍生物的过程。
2、基于化合物后修饰基因的组合生物合成
利用外源的后修饰酶能够扩大代谢产物的结构多样性。
包括基于卤化酶、羟化酶P450、甲基化酶或氧甲基化酶、酰化酶以及糖基化酶基因的组合生物合成。
3、基于主骨架合成基因突变的组合生物合成
(1)聚酮化合物的组合生物合成
a.改变DEBS组成模块(如减少、添加和替换等)产生新结构化合物
b.改变DEBS的结构域合成新结构化合物
c.同时改变DEBS的模块和结构域,合成新型聚酮化合物
d.改变PKS(聚酮合酶)的后修饰酶或者添加底物类似物,合成新结构化合物或衍生物
(2)非核糖体肽化合物的组合生物合成
a.NRPS亚基/模块/亚结构域/结构域的替换
b.NRPS模块/结构域的删除与插入
c.NRPS结构域的定点突变与定向进化
(3)核苷肽类化合物的组合生物合成
例如:
尼可霉素与多氧霉素都属于核苷肽类抗生素,他们的化学结构具有明显的不同,导致其各具优势和不足。
多氧霉素生物合成基因簇中polLMNOP负责肽基部分的合成。
将构建好的pPOL2导入尼可霉素肽基部分合成缺失的圈卷产色链霉菌中,就会合成肽基来源于多氧霉素而核苷部分来源于尼可霉素的杂合抗生素,兼具二者稳定性好和活性强的优点。
(4)香豆素类化合物的组合生物合成
2、结合谷氨酸棒杆菌中谷氨酸生物合成途径,阐述提高谷氨酸产量的可能途径或方法。
1、自然诱变
2、单基因敲除:
α-KGA(α-酮戊二酸)脱氢酶:
α-KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物,只有当体内α-KGA脱氢酶活性很低时,TCA循环才能够减弱,α-KGA才得以积累,为谷氨酸的生成奠定物质基础。
3、双基因敲除:
同时敲除乙酰辅酶A羧化酶(△dtsR1)和丙酮酸羧化酶(△pyc)基因,可使菌体在无诱导剂的条件下产L-谷氨酸。
加入生物素,双突变菌株L-谷氨酸产量较野生型提高13.1%;
吐温40可通过抑制DstR活性使脂肪酸合成降低,进而提高谷氨酸产量。
4、引入外源基因:
来自透明颤菌的血红蛋白VHb可以提高重组菌的呼吸效率,使菌体生长速度、L-谷氨酸产量和葡萄糖消耗量增加。
5、增强酶活性:
(1)CO2固定反应的酶系:
菌种能利用CO2产生大量草酰乙酸,有利于谷氨酸大量积累。
(2)L-谷氨酸脱氢酶:
使α-酮戊二酸易生成谷氨酸。
该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联。
6、调节乙醛酸循环的关键酶活性:
异柠檬酸裂解酶,通过对该酶活性的调节来实现DCA循环的封闭,使糖的代谢能沿着α-酮戊二酸的方向进行,从而有利于谷氨酸的积累。
7、减弱或清除对NADPH的氧化能力:
由于NADPH的氧化能力欠缺或丧失,使得体内的NADPH有一定积累,NADPH对于抑制α-KGA的脱羧氧化有一定的意义。
8、增强分泌系统:
在合成系统已经很强大的情况下,可以考虑通过增强分泌系统来降低细胞内氨基酸的浓度,降低合成的抑制作用,从而提高产量。
第三章第1、2、3节
调控基因在抗生素生物合成中有何主要功能?
在抗生素的生物合成中调控基因起到开关的作用,它可以决定一种抗生素生物合成的起始与终止的精细调控过程。
1、途径特异性调控:
调控基因只负责调控所在基因簇基因表达的调控方式。
途径特异性调控蛋白如SARP蛋白,SARP蛋白都含有OmpR类的DNA结合结构域和转录激活结构域,通过招募RNA聚合酶到靶基因的启动子上游激活基因的转录。
大多数SARP蛋白都是途径特异性调控子,一般只调控与其相邻的基因。
2、全局性调控:
全局性调控蛋白直接或间接地调控途径特异性调控蛋白(由调控基因编码),是一种更为多样、普遍、复杂的调控模式。
全局调控基因可以调控多条次级代谢途径。
除了调控次级代谢产物的生物合成外,很多全局调控蛋白还控制着链霉菌的形态分化,还有一些能够调控初级代谢,并成为初级代谢向次级代谢转换的媒介。
Eg.双组份信号转导系统、AdpA等。
3、自调控
(1)反馈调控:
即终产物对合成基因簇中的调控基因或关键酶基因进行调控。
(2)前馈调控:
即底物或中间物对合成基因簇中调控基因或关键酶基因进行调控。
抗生素作为终产物介导的自调控系统可取代双组分系统中通过磷酸化作用的应答调控机制,并证明这种新调控机制在微生物次级代谢生物合成中是广泛存在的。
1、途径特异性调控
即调控基因只负责调控所在基因簇基因表达的调控方式。
以多氧霉素生物合成的途径特异性调控为例:
在基因簇中,polY和polR是调控基因,其他都是相关结构基因。
PolR特异性结合polC和polB的启动子区域,激活18个结构基因的转录,而PolY通过激活polR转录,间接地调控多氧霉素的生物合成。
PolY通过感应ADP/ATP的浓度来调控polR的转录:
PolY的ATPase结构域可以通过结合ADP和ATP改变PolY对DNA的亲和力及寡聚化状态,进而影响靶基因的转录水平。
2、全局性调控
即全局性调控蛋白直接或间接地调控途径特异性调控蛋白(由调控基因编码)。
以尼可霉素的生物合成调控为例:
基因簇由22个基因组成,其中结构基因21个,sanG是唯一的途径特异性调控基因。
AdpA是全局性调控因子,与多种抗生素的合成以及链霉菌形态分化相关,sanG是AdpA的一个靶基因。
实验证明,AdpA可与sanG上游的五个位点结合,顺序为SiteI>
SiteV>
SiteIV>
SiteII>
SiteIII。
AdpA以正负两种不同的模式行使对调控基因sanG的调控。
其中,位点I和V是正调控,而位点II,III和IV是负调控。
3、自调控
以杰多霉素的生物合成调控为例:
基因簇中包含4个调控基因,即jadR1、jadR2、jadR3和jadR*。
JadR1和JadR2介导杰多霉素生物合成的反馈调控。
JadR1是OmpR家族的非典型应答调控子(ARR),可以结合jadJ和jadR1的启动子区域,而杰多霉素JdB可以将JadR1从启动子区域解离下来。
这种由抗生素介导的反馈调控可以取代双组份系统中通过磷酸化作用的应答调控机制。
JadR*介导杰多霉素生物合成的前馈调控。
jadY是JadR*的主要靶基因,JadR*可与jadY的启动子区结合,JdB及其中间产物能影响JadR*的结合能力,其中以DHR的能力最强。
jadY的作用是通过前馈机制调控杰多霉素生物合成中JadG催化的氧化开环反应中辅因子FMNH2/FADH2的供给。
第三章第四节群体感应信号分子介导抗生素生物合成的分子调控
链霉菌信号分子有哪几种类型?
已知结构的链霉菌群体感应信号分子有24种。
按结构可以分为以下五种类型:
1).含有γ-丁酸内酯呋喃环结构的GBL家族;
2).PI因子(pimaricin-inducerfactor);
3).MMF(methylenomycinfuransfactor);
4).丁烯醇(丁烯羟酸内酯)结构的avenolide(S.avermitilisbutenolide)和SRBs(Streptomycesrocheibutenolides);
5).二酮哌嗪(diketopiperazine)类化合物。
GBL类型的信号分子在抗生素的生物合成中如何发挥其功能?
以链霉素的生物合成为例:
在低细胞密度时,信号分子(A因子)的受体蛋白ArpA与多效调控基因adpA的启动子区结合,阻遏了adpA的转录。
当细胞密度升高,A因子积累到阈值时,它与ArpA结合,使ArpA从adpA上解离,导致adpA有效地进行转录。
翻译后的AdpA控制链霉素生物合成基因簇中调控基因strR的转录,StrR激活strB1开始的转录单元的基因转录,从而调控链霉素的生物合成。
第三章第五节基因组挖掘及隐性次级代谢基因簇的激活
有哪些方法可以激活隐性基因簇表达得到新型抗生素?
1.更多链霉菌基因组的测序及挖掘:
随着更多链霉菌基因组的不断完成和信息积累,为抗生素生物合成基因簇的研究,发现新型抗生素提供了重要的条件。
大量的链霉菌尚未测序,这极大地影响了新型抗生素的发现。
每个基因组平均含有20-30个左右次级代谢产物生物合成基因簇,大多数是未知的,这将是发现新型抗生素的庞大资源。
2.培养条件的优化:
不同的营养(如碳源和氮源等)条件导致微生物不同的生理代谢。
次级代谢产物的生物合成是与前体的提供和相关因子的诱导密切相关的。
同时,相关菌株的共同培养可以提供互补的重要物质和信息交流,为隐性次级代谢基因簇的激活提供了可能的条件。
3、调控子的遗传操作:
去除负调控基因的阻遏,构建正调控基因的有效表达,或者对转录单元中启动子的替换和定向改造都是隐性次级代谢基因簇激活的有效方法。
4.基因簇的异源表达:
为了消除菌株本身的一些限制因素(如抑制物的存在,合成底物的缺乏等),进行隐性次级代谢基因簇的异源表达也是值得尝试的方法。
5.信号分子介导的激活:
已证明信号分子可以介导隐性次级代谢基因簇的激活,例如,γ-丁酸内酯通过与相应的受体蛋白相互作用激活放线菌中多种次级代谢产物的生物合成。
所以,未来研究的方向:
发现新信号分子,研究其在抗生素产生和种间交流中的作用机制;
同时可用于激活隐性基因簇;
同时,探索抗生素作为信号分子的生物学功能。
6.核糖体工程:
在链霉菌中,核糖体蛋白S12的突变同样可以影响抗生素的产量。
7、其他新方法和策略:
未来可能的突破:
以链霉菌为模式,进一步阐明抗生素生物合成与调控机制,为提高重要抗生素的产量乃至激活隐基因簇,挖掘新型活性次级代谢产物方面做出创新性的研究成果;
深入开展抗生素的组合生物合成和合成生物学的研究,突破天然产物合成过程中的瓶颈,获得在结构和功能上具有突出特点的新型活性化合物。
第四章第一节大肠杆菌
结合大肠杆菌(致病和非致病)的细胞结构特征及其生物大分子的生物合成规律,简述若干药物研发的策略。
(一)针对致病性大肠杆菌的药物研发策略:
(1)外排泵抑制子作为药物靶点:
外排泵可以使细菌获得多重抗药性,外排泵基因的表达一般同时受到相邻的局部调控蛋白和全局性调控蛋白的调控。
当抑制子发生突变时,可以解除其对激活子或靶标的抑制,导致外排泵过表达;
同时,抗生素或小分子的结合,也可以解除抑制子对激活子的抑制作用,诱导其过表达。
因此,抑制子可以作为潜在的药物靶标。
筛选能够结合抑制子RamR的小分子,使其对激活子RamA(氟喹诺酮类药物抗性相关)的抑制作用加强,从而降低外排泵的表达而降低细菌的抗性。
通过解析RamR和小分子复合物的结构,发现关键残基Phe155,有助于筛选与其结合的潜在药物。
(2)转肽酶作为药物靶点:
大肠杆菌的细胞形态由肽聚糖层维持,可以抵抗渗透压力。
在细胞外,肽聚糖的合成与水解反应并存,主要发生转糖基和转肽反应,也包括后续的糖链末端修饰和与外膜蛋白的交联。
参与这些反应的酶大多是药物的潜在作用靶点。
青霉素可以竞争结合转肽酶,导致肽桥不能形成而抑制细胞生长。
(3)外膜定位脂蛋白Lpo作为药物靶点:
肽聚糖合成酶PBP是一个高分子蛋白,直接负责糖链的聚合与交联。
通过转座子突变体库筛选得到与PBP相互作用的外膜定位脂蛋白Lpo,进一步的蛋白定位研究发现,Lpo可以跨越肽聚糖层孔洞直接激活PBP。
因此,基于Lpo对肽聚糖合成和细胞生长的重要性,其也是一个潜在的药物靶点。
(二)利用非致病大肠杆菌合成相关药物:
A、大肠杆菌产生蛋白类药物:
对大肠杆菌进行定向遗传改造,使其成为蛋白药物表达的宿主。
构建包含有目标蛋白基因的质粒载体,将其导入大肠杆菌细胞中;
也可以通过同源重组将目的基因整合到染色体上进行稳定表达。
B、利用大肠杆菌细胞高产抗癌药物紫杉醇的前体:
紫杉醇是萜类化合物(三环二萜),天然的大肠杆菌MEP途径可合成其中2个前体IPP和DMAPP。
上游模块改造:
增加整个MEP途径的拷贝数;
在染色体中引入T7RNA聚合酶,并在限速酶前引入T7启动子;
通过不同质粒的引入和改变启动子强度来协调不同基因的拷贝数以及表达量;
将合成酶基因整合到染色体上,减小代谢负担。
下游模块改造:
改变GGPS和TS两个合成基因的顺序;
通过启动子更换以及改造,协调基因的表达量;
去除代