微生物遗传复习.docx

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微生物遗传复习

Ames试验原理：

鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变细胞外，只能分裂几次，形成显微镜下才可见的微菌落。

受诱变剂作用后，大量细胞回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。

菌株鉴定：

用于测试的菌株，需经基因型和生物学性状鉴定，符合要求才能投入使用。

鉴定项目：

脂多糖屏障丢失；R因子；紫外线损伤修复缺陷；自发回变；回变特性

1.脂多糖屏障丢失（rfa）

用滤纸浸染结晶紫溶液，贴放在平板上与各接种平行线垂直相交，培养24h后观察结果。

2.R因子

用滤纸条浸湿氨苄青霉素钠溶液，贴放在平板上，再另用滤纸条浸湿四环素溶液后贴放于划线接种的平板上。

3.紫外线损伤修复缺陷（△uvrB）

划线接种后，一半接种线用黑玻璃遮盖，另一半暴露于紫外光下8sec，然后盖好皿盖并用黑纸包裹平皿，防止可见光修复作用。

培养同上。

4.自发回变

预先制备底平板；向灭菌并在水浴内保温45℃的上层软琼脂中注入0.1ml菌液；混匀后倾于底平板上并铺平。

平皿倒置于37℃温箱培养48h。

5.回变特性——诊断性试验

上层软琼脂中除菌液外，还注入已知阳性物之溶液，需活化系统者并加入S9mix，余同上。

组氨酸营养缺陷型由自发回变即可知。

目前推荐使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。

鉴定前先进行增菌培养。

为鉴定结果可靠，需同时培养野生型TV菌株，作为测试菌基因型之对照。

3、试验方法

1.斑点试验

1）.吸取菌液0.1ml，注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中混匀，倾于平板上，铺平冷凝。

2）.用纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基的表面，做溶剂对照和阳性对照。

在纸片外围长出密集菌落圈，为阳性；菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。

2.平板掺入试验

1）.将样液和测试菌液均加入上层软琼脂中，混匀后迅速倒平板。

2）.同时做阴性和阳性对照，每种处理做3个平行。

试样通常设4个～5个剂量。

同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比（MR）。

MR值≥2，且有剂量-反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。

四、应用

1．斑点试验只局限于能在琼脂上扩散的化学物质，适用于快速筛选大量受试化合物。

2．平板掺入试验可定量测试样品致突变性的强弱。

此法较敏感，获阳性结果所需的剂量较低。

3．致变作用迟缓或有抑菌作用的试样，培养时间延长至72h。

4．挥发性液体和气体试样，可用干燥器内试验法测试。

5．目前，Ames试验作为检测环境诱变剂的一组试验中的首选试验，广泛应用于致突变化学物的初筛

端粒酶如何保护染色体的-------------端粒酶解决末端丢失问题的原因

真核生物线性DNA的复制始于内部起始点，以短链RNA分子作引物，沿5’→3’方向延伸互补链。

其中，前导链连续合成，后随链先分段沿5’→3’方向合成冈崎片段，然后切去各段引物，再由DNA连接酶将冈崎片段连接成完整的DNA链。

分析上述过程时不难发现，由于DNA聚合酶不能催化DNA链3’→5’方向的延伸，子代DNA链5’端的引物被切去后会留下一段空隙，导致子代DNA分子上有一段不完整的5’末端，DNA链也会随着不断的复制而逐渐缩短。

端粒酶是一种能将真核生物染色体末端DNA端粒DNA加以延伸的酶．它是一种核酸蛋白质复合物．目前认为端粒酶是由端粒酶RNA组分（telomer2LseRNA，TR），端粒酶相关蛋白和端粒酶催化亚基三部分组成的蛋自质复合物．

p123和EST2蛋白上的逆转录酶基序对于端粒酶催化延伸端粒至关重要，说明端粒酶是一种特殊类型的逆转录酶，其能以自身含有的RNA为模板，延伸染色体的端粒，保证染色体末端复制的完整。

端粒酶催化端粒延伸模型嗜热四膜虫端粒G链上带有一个13个碱基的悬突（0velllng）

（1）端粒酶识别端粒底物末端的TTGGGG重复序列，并与端粒酶RNA上的5"-CAACCCCAA-37模板序列配对；

（2）合成TrG序列；（3）端粒酶移位使末端的TrGGGGTIV,重新与模板序列配对；（4）继续延伸端粒，复制模板序列完成TTGGGGTrG序列的合成。

能沿3’硝’方向先将G链延长，再以此为模板合成互补的c链，这样就保证了子代DNA链5’端的完整性

测定从单个细菌中裂解的噬菌体的数目

实验原理：

利用单细胞裂解实验，将感染噬菌体的细菌悬浮液在潜伏期之前进行高倍稀释，注入多个试管中，使每个试管中的细菌数量不超过一个。

经过一段时间发生溶菌后，测定各试管中产生的全部噬菌体数，得知各个细胞产生的噬菌体数目。

研究噬菌体感染的方法

1.噬菌斑

是噬菌体感染宿主细菌后在含受体菌的涂布平板上形成肉眼可见的透明圈。

嗜菌斑的大小、形状和透明度、边缘是噬菌体的特征。

一个嗜菌斑是由原来的一个噬菌体侵染细菌后再反复侵染造成细菌裂解的结果。

2．感染复数（multiplicityofinfection，m）

m值为单个宿主细菌细胞感染的噬菌体颗粒数，它等于试验时所用的噬菌体与细菌的数量比例，即：

m＝噬菌体颗粒数/宿主细菌细胞数m值>1000时，宿主细胞常因噬菌体的过度侵染而死亡，以致难于实现噬菌体的复制和扩增。

因此，通常在制备、扩增或保存噬菌体裂解液时，应将m值控制在2—5之间。

进行噬菌体杂交试验时，m值以5—10为宜。

测定噬菌体的一步生长曲线或裂解液效价时，m值应更低，通常为10-6数量级

实验材料：

E.coliK12F菌种，牛肉膏蛋白胨固，液体培养基，磷酸缓冲液，氯仿，噬菌体裂解液，素琼脂液体。

实验步骤：

1.制备一定浓度的大肠杆菌悬浮液

2.制备一定浓度的噬菌体试样

3.将试样噬菌体与敏感大肠杆菌细胞按一定M值混合

4.稀释混合菌液，并分装到一系列试管保存

5.将试管中样品与大量敏感细菌混合

6.涂布培养

7.观察并记录每个培养皿上长出的噬菌斑的个数

1.制备一定浓度敏感的大肠杆菌悬浮液

从E.coliK12F菌种斜面上取一环菌种，接种于2mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，离心10min，弃去上清液，用等体积磷酸缓冲液悬浮细胞，制成菌悬液。

将菌悬液加至带有搅拌子的小培养皿中，并将培养皿置于紫外灯下方的磁力搅拌器上，先照射1min后打开皿盖，同时打开搅拌器开关，用紫外线准确照射13s后马上盖上皿盖。

处理后加入2mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃条件下恒温避光培养2h。

取上述已避光培养的培养液4mL，加至无菌离心管中，然后加入0.2mL氯仿，振荡，静置5min后离心10min。

并将上清液吸入新的无菌试管中，在4℃冰箱中冷冻备用。

2.制备一定浓度的噬菌体试样

将噬菌体裂解液活化后，取0.5mL，用4.5mL/管的牛肉膏蛋白胨液体培养基进行10倍系列稀释至稀释到原液的10-4。

将素琼脂培养基融化后向每个试管中加入4mL50℃的素琼脂液体，待使用。

3.将供试噬菌体与敏感细菌按一定的m值混合，吸附5min后立即取样并将菌液稀释至每毫升只含2-3个敏感细菌细胞，再从中取0.2mL分装到一系列试管中（这样每一试管平均不到1个寄主细胞）。

保存30min后将样品与大量敏感细菌混合后再涂布在培养平板上，经培养后将从每一培养皿上长出的噬菌斑数平均，即为该噬菌体的裂解量。

预测实验结果

实验结果有三种类型：

第一种是大部分培养皿上没有噬菌斑；

第二种是少数培养皿上出现几十甚或一千以上个噬菌斑；

第三种是大部分是单个细菌所释放的噬菌体所形成的噬菌斑。

噬菌体TI的单菌释放量多数是100—200。

MS2可高达5—10×103。

两种噬菌体同时感染，出现噬菌斑则为什么说是突变不同基因位点

未出现噬菌斑为什么说突变同一个基因的不同位点

噬菌体互补测验

实验材料为：

五种噬菌体：

rIIa1rIIa2rIIb1rIIb2野生型

两种受体细菌：

K12（λ）型B型

概念：

噬菌体T4突变体rII的很多表型相同的突变型，能在E.collB中生长，不能在E.collK（λ）中生长。

已知野生噬菌体能产生噬菌斑，rIIa1，rIIa2，rIIb1，rIIb2均不能单独产生噬菌斑。

证明突变的显隐性：

和野生型噬菌体同时入侵一个大肠杆菌，若有噬菌斑则突变为隐性，若没有噬菌斑则突变为显性。

用两种突变噬菌体同时入侵大肠杆菌

噬菌体突变型的互补测试

质粒消除时，用的方法都是会引起基因突变的诱变剂，在进行质粒消除实验时，如何进行区分？

质粒消除方法

燃料类非啶类，二苯甲烷类

表面活性剂十二烷基磺酸钠苯硫酚某些脂肪酸

抗生素福利脱氧尿苷利福平大炭霉素

其他高温紫外线辐射胸腺嘧啶饥饿处理

Pcr

利用已知序列，筛选质粒特定序列，并设计引物

配制体系，进行PCR

将反应产物跑DNA琼脂糖凝胶电泳

1.若出现条带则，说明质粒消除失败

2.若不出现条带，则说明质粒消除成功

质粒筛选抗性

利用已知序列，分析筛选是否有抗性基因（如氨苄青霉素抗性、卡纳抗生素抗性）

利用固体基础培养基培养（加抗生素）

1.若菌生长，则说明质粒消除失败

2.若菌不生长，则说明质粒消除成功

琼脂糖电泳

利用一定方法抽提DNA（如CTAB法、异硫氰酸胍法、碱裂解等）

将抽取的DNA跑琼脂糖凝胶电泳

1.若出现两条带，则质粒消除失败

2.若出现单一条带，则质粒消除成功

回复突变

将菌在基础培养基上培养并传代

1.若传代若干次后，产生原有性状菌体，则质粒消除失败

2.若传代若干次后，不产生原有性状菌体，则质粒消除成功

如何分析两个质粒是否能共存于同一个宿主细胞中？

——质粒的不相容性

质粒不相容性的定义：

1.同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性

2.当一种新的质粒进入已经含有质粒的细胞中时，若两种质粒同源或近缘，它们就会竞争资源，而竞争的结果就是一个胜利另一个则被消除。

但此过程需要几代或几十代或更长的细菌繁殖周期，而并不是一个快速的过程。

（存在松弛控制型质粒）

3.不相容群：

两种质粒被吸入同一个细胞内，则他们是相容的，属于不同的不相容群。

若两种质粒不能共存于统一细胞内，那么它们是不相容的。

质粒不相容的机制：

1.在保有质粒来说十分重要的某个阶段，它们不能彼此区分，这些阶段如DNA复制和分离。

2.阻遏蛋白：

细菌质粒复制过程中产生一种专一性的阻遏蛋白，它抑制质粒的进一步复制，阻遏蛋白本身也同时停止增加。

在细菌生长分裂过程中，阻遏蛋白逐渐稀释，这时质粒便开始复制。

3.负控制模型：

同一不相容群中的不同质粒，若复制子高度同源时，其产生的阻遏蛋白相同，因此若其中一个质粒复制后，增加了阻遏蛋白的浓度，从而阻止第二个质粒的复制，保证正常的拷贝数，使得同一不相容群中的不同质粒不能共存于同一细胞中。

质粒不相容的原因：

有着相似的分配系统两个质粒也有可能不相容。

如果分配装置形成了一个不同质粒的混合对，这可能会导致在细胞分列式一个质粒的两个拷贝进入相同的子细胞，其结果是每个细胞都不携带两个质粒。

质粒不相容的检验：

质粒的不相容性可以使用将一个质粒转入含有另一个已知质粒的菌体，看其是否能够获得新的质粒进行确定。

如果所有的菌株都失去了原有的质粒，那么这两个质粒就属于同一不相容群。

（此种方法只适用于严谨控制型质粒。

）

Trp突变株遗传分析

本实验为什么使用不加色氨酸的基本培养基？

如果添加色氨酸结果如何？

本实验的目的在于各突变株在特定条件下的表达情况，其判断指标为能否在给定的培养基上生长。

如果实验所用的培养基加入Trp，无论各突变株的表达情况如何，所有突变株都能获得所必需的色氨酸而于培养基上正常生长，进而就不能考察各突变株的色氨酸表达情况。

trp101～trp107哪些属于条件突变，是否为错义、无义、移码、插入或缺失突变？

为什么？

无义突变：

单个碱基置换导致出现终止密码子（UAG、UAA、UGA）时，多肽链将提前终止合成，所产生的蛋白质（或酶）大都失去活性或丧失正常功能。

错义突变：

碱基置换后结果产生异常蛋白质和酶。

但也有不少基因由于错义突变而产生部分降低活性和异质组分的酶，从而不完全抑制了催化反应，这种基因称为漏出基因

移码突变：

DNA链上插入或丢失非3的整数倍个碱基，在读码时，由于原来的密码子移位，导致在插入或丢失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。

移码突变造成的肽链延长或缩短。

插入、缺失突变：

DNA分子插入、丢失一段碱基序列。

由本例现有信息及上述分析推断可知，103、104、105、106、107为条件突变且同时最可能是缺失突变。

101为无义突变，102最可能为错义突变。

解释9~12的双突变结果，是否可判断这些基因产物在色氨酸合成途径中的作用顺序？

如何选择trp101的回复突变？

选择适当的方法和试剂对trp101突变株进行诱导；

将上述经诱导处理的突变株接种到基本培养基上培养；

再将上述培养得到的每系株种经饥饿处理后分别接种到相同温度梯度的一系列不含色氨酸的基本培养基上；最后记录各株种的生长情况，统计生长情况，分析得出结论。

问答题

设计从土壤中筛选能产生淀粉酶的地衣芽孢杆菌的实验过程。

1） 采样  （1分） 

2） 富集培养  取土样平摊于一干净的纸上，从四个角和中央各取一点土，混匀，称取1g，置于装有肉汤培养基的三角瓶中，于80~90℃热水浴中保温10~15min，然后于28℃摇床上振荡（120r/min）培养24h。

（2分） 3） 涂布分离 

① 将培养液再一次热处理后，以10倍稀释法适当稀释，取最后三个稀释度的稀释液各0.1ml于无菌的淀粉培养基平板中，每个稀释度平均两皿。

（2分） 

② 用灭过菌的涂布棒将菌液均匀涂布在淀粉培养基平板上，倒置于30℃培养箱中培养24~48h。

③ 挑菌落  用碘液滴加在具有单菌落的淀粉平板中的菌落周围，由于菌落周围淀粉被水解而为无色透明，远离菌落的淀粉会与碘液反应呈兰色，因此可以根据透明圈直径和菌落直径比值（H/C）大小，挑取比值大的菌落，接种于斜面，30℃培养24h，备用。

（3分） 

4）纯种鉴定  菌种经革兰氏染色，油镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。

（1分） 

5）纯化  将选定的菌株，于淀粉培养基平板上采用平板划线分离技术进行纯化。

（1分）

 2.在人类基因组计划的执行甲，为什么要进行以微生物为主体的模式生物的全基因组序列测定?

哪几种生物分别是已完成全基因组测序的第一个独立生活的生物?

第一个真核生物?

第一个自养生活的生物?

因为微生物基因组小，便于测定和分析，可从中获取经验改进技术方法，从而大大加快了人类基因组计划的进展。

此外，微生物基因组包含着原核生物和真核生物，具有一定的代表性。

第一个测序的自由生活的生物是流感嗜血杆菌，第一个测序的真核生物是酿酒酵母，第一个测序的自养生活的生物是詹氏甲烷球菌.

 3.在细菌细胞中，均以环状形式存在的染色体DNA和质粒DNA，在质粒提取过程中发生了什么变化?

这种变化对质粒的检测和分离有什么利用价值?

由于染色体DNA分子比质粒DNA分子大得多，在提取过程中易于断裂成大小不同的分子片段，但一般情况下仍然比质粒大，因此在琼脂糖凝胶电泳过程中随机断裂的染色体DNA片段，泳动速度较慢且带型不整齐，而质粒DNA由于相对分子质量小，在提取过程中一般不会断裂成小片段，相对分子质量一致，因此，泳动速度较快，且带型整齐，与染色体DNA分开，从而有利于质粒DNA的检测和分离。

4.根据你所学的关于诱发突变的知识，你认为能否找到一种仅对某一基因具有特异性诱变作用的化学诱变剂?

为什么?

理化诱变剂的作用主要是随机引起DNA链上碱基发生置换、颠换或其他损伤，虽然有突变热点，但并非针对某一基因，诱变剂无基因特异性，诱变作用主要是提高突变率。

因此，要获得某一基因的突变不是靠选用何种诱变剂，而是靠合适的筛选方法。

5.根据突变的光复活修复作用、原理，你认为在进行紫外线诱变处理时，应注意什么?

为了使被诱变的细胞能均匀地受到紫外线照射，你将如何做?

在进行紫外线诱变处理时应注意避光，以防光复活修复作用。

一般在红光下操作，在黑暗中培养。

在紫外线照射时，盛菌液的培养皿应置于磁力搅拌器上，边照射边搅拌使细胞能均匀受到紫外线照射。

6.请设计实验来决定在一种特定的细菌中发生的遗传转移过程是转化、转导还是接合?

说明每一种的预期结果。

设想有下列条件和材料可以利用：

（1）合适的突变株和选择培养基。

（2）DNase（一种降解裸露DNA分子的酶）。

（3）两种滤板：

一种能够持留细菌和细菌病毒，但不能持留游离的DNA分子；另一种滤板只能持留细菌。

（4）一种可以插入滤板使其分隔成两个空间的玻璃容器（如u型管）。

A将两种不同的二重或三重营养缺陷型菌株混合培养，在基本培养基上长出的菌落为重组菌株（发生了遗传交换）。

B如果在混合培养期间加入DNase，在基本培养基上无重组菌落出现，这说明上述重组是因细胞间的接触转化所致；如果仍有重组落产生，说明可能是由于接合和转导所致。

C利用只能持留细菌的滤板相隔的u型管进行试验，如果在基本培养基上不产生重组菌落，则判断为接合作用，如果产生重组菌落，则又有两种可能，即转化或转导。

D利用能持留细菌和细菌病毒而不能持留DNA的滤板相隔的u型臂试验，如果不产生重组菌落则为转导，如果仍产生重组菌落则为转化。

7.在第（6）题的实验中，为什么用双重或三重营养缺陷型？

为了排除在基本培养基上长出的原养型菌落是由于回复突变这一可能性。

因为同时发生2个基因或3个基因的基因突变是不可能的。

在大肠杆菌中，单营养缺陷型的回复突变率大约是10-8。

8.Hfr ?

/SPAN> F-和F ?

F-杂交得到的接合子都有性菌毛产生吗?

它们是否都能被M13噬菌体感染呢?

Hfr × F-中，由于Hfr菌株的染色体在向F-的转移过程中，整合在染色体上的F因子除先导区外，绝大部分处于转移染色体的末端，由于转移过程中常被中断，因此P因子不易转移到受体细胞中，所以Hfr × F-得到的接合子仍然是F-，无性菌毛产生；F+ × F-得到的接合子有性菌毛产生，能被M13噬菌体感染，因为M13的侵染途径是性菌毛。

9.为什么导致蛋白质表面氨基酸变化的突变一般不会引起表型的变化?

而蛋白质内部氨基酸的替换则会引起表型变化?

蛋白质表面氨基酸的变化一般不影响蛋白质的功能，因此一般不会引起表型的变化，但如果突变引起蛋白质内部的氨基酸发生变化（包括酶的活性位点），就可能剧烈地改变蛋白质的三维结构，从而改变其功能，破坏酶的活性。

10.DNA链上发生的损伤是否一定发生表型的改变?

尽你所能说出理由？

不一定，如下列情况：

①同义突变或沉默突变；②发生了基因内另一位点或是另一基因的抑制突变（一般指tRNA基因的突变）使突变得到校正；③即使是错义突变，但是否改变表型还视置换的氨基酸是否影响蛋白质的功能；④各种修复机制可清除DNA的各种损伤，使其表型不发生改变。

11.何为SD序列，如何对翻译进行调控？

SD（Shine-Dalgarno）序列：

存在于RBS中，一般为5个核苷酸组成的富含G和A的短小序列。

其功能是与核糖体16srRNA的3’端互补配对，使核糖体结合到mRNA上，以利于翻译的起始。

调控机制：

（1）SD序列与16S rRNA序列的互补程度；

（2）AUG到SD序列的距离，一般为4~10个核苷酸，9个最好；（3）mRNA 5’端的空间结构影响30S亚基和mRNA的结合。

12．简述不依赖于ρ因子的终止子的结构及其终止转录的机制。

结构特点：

在转录终止点之前有一段长度为7~20bp的反向重复序列，反向重复序列中GC含量高，而且反向重复序列下游常有6~8个A。

转录终止机制：

反向重复序列转录后，在转录泡中，形成的mRNA容易形成RNA-RNA发夹结构，其稳定性比转录产物mRNA和DNA的结合稳定性高，导致RNA从RNA-DNA杂合链上脱离，结果RNA聚合酶和RNA都从DNA链上脱离下来，转录终止。

13．解释端粒和端粒酶，以及二者各有何功能？

端粒是位于真核生物染色体末端的一种特殊的结构，主要由一非常简单、富含G的重复序列组成。

具有保护DNA双链末端免遭降解及彼此融合的功能。

端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的酶，其中RNA序列和端粒中的重复序列类似，可以和端粒重复序列互补，以RNA为模板，催化合成端粒的DNA，确保真核生物DNA复制时后随链缩短情况的发生。

14.简述DNA shuflling基本原理 

先将来源不同但功能相同的一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片段，由这些小片段组成一个文库，使之互为引物和模板，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝引物时，引起模板转换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮的体外重组。

一般通过2~3个循环，得到产物大幅度提高的重组突变体。

15．简述色氨酸弱化作用的调控机制。

在色氨酸操纵子前段有一段前导转录序列，不编码色氨酸利用相关基因，但编码一段前导肽。

在前导转录序列中有四段碱基序列，相邻的两端之间可以互补配对形成发夹结构。

 在前导肽的编码区内部有两个串联的色氨酸密码子，再后面不远处有一个翻译终止密码子。

当色氨酸浓度低时，4区被转录完成时，核糖体还停止在1区之前，干扰1区和2区的配对，结果形成2-3配对，3无法和4配对，不形成终止子。

转录正常进行。

当色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过1区，达到2区，无法形成2-3配对，形成3-4配对的径环终止结构。

16．简述噬菌体和宿主间的溶源性关系。

以及噬菌体UV诱发裂解实验中，缓冲液中镁离子的作用和在获得噬菌体裂解液时加入氯仿处理的目的。

答案要点：

有些噬菌体在吸附和侵入宿主细胞后，其基因组并不接管和杀死宿主，而是存留在宿主细胞内整合到宿主核基因组，同宿主基因组一起复制，产生一群携带噬菌体基因的细胞，而宿主依然表现正常，可长期生长和繁殖，但这些细胞在适宜的环境条件下会产生并释放噬菌体。

这种噬菌体和宿主之间的关系称为溶源性。

镁离子的作用是促进裂解；获得噬菌体裂解液时加入氯仿处理的目的是使蛋白变性，使细胞碎片沉淀。