三种消化酶测定.docx

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三种消化酶测定

三种消化酶测定

蛋白酶活力的测定

[目的与原理]

掌握蛋白酶活力的测定方法，测定鱼、虾、贝等水产动物主要消化器官肝胰脏、胃、肠等蛋白酶的活力。

动物消化器官内含有各种消化腺，这些消化腺分泌消化酶进行化学性消化作用，将机体摄入的大分子营养物质转变为可溶性小分子物质而吸收进入血液循环。

本实验采用福林—酚法测定机体内主要消化酶—蛋白酶活力。

福林—酚试剂（Folinphenol）在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物。

蛋白质中含有酚基的氨基酸包括（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用蛋白酶分解酪蛋白（底物），生成含酚基的氨基酸与福林－酚试剂成蓝色反应，可从蓝色的深浅测知酶活力多少。

[试剂与器材]

试剂：

1、福林试剂：

在2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g，水700ml，35％磷酸50ml，浓盐酸100ml，文火回流10小时，然后加人硫酸锂50g，水50ml和溴水数滴，摇匀，去除冷凝器，继续煮沸15分钟，以除去多余的溴。

溶液呈金黄色，冷却后，定容至1000ml，过滤，滤液即福林试剂（试剂不应呈绿色，否则需重配）。

置于棕色瓶中保存，使用时用氢氧化钠标定，稀释至1N。

2、0.55M碳酸钠溶液

3、10％三氯乙酸

4、0.02MpH7.5磷酸缓冲液：

0.02M磷酸氢二钠溶液的配制：

取Na2HPO4·2H2O3.561g（或Na2HPO412H2O 7.164g），溶解于1L蒸馏水中。

0.02M磷酸二氢钠溶液的配制：

取NaH2PO4H2O 2.76g（或NaH2PO42H2O3.121g），溶解于1L蒸馏水中。

将0.02M磷酸氢二钠溶液84ml与0.02M磷酸二氢钠溶液16ml混合，即为0.02MpH7.5磷酸缓冲液。

5、0.5％酪素：

（酪蛋白）0.5克，以0.5NNaOH1ml湿润。

再加少量0.02MpH7.5磷酸缓冲液稀释。

在热水浴中溶解，定容至100ml，冰箱中可保存一周。

材料：

鲜活鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。

器材：

分光光度计、光径1.0cm比色杯、离心管、电子天平、离心机、匀浆器、剪子、镊子、冰块、试管若干、移液管若干。

[实验步骤]

1、酶粗提液的制备

取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重，在冰盘上剔除脂肪及内容物，以10倍缓冲液或去离子水匀浆各组织，将组织悬液低温下离心（3000rpm/min）,上清液为酶粗提液（酶液）。

2、酶活力测定

（1）标准曲线的制作：

精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2N盐酸溶解，定容至100ml，分别配制溶液0—100μg/ml不同浓度溶液，不同浓度各取酪氨酸溶液1ml，加0.5％酪素2ml，于370C水浴中反应15分钟，然后加入三氯乙酸3ml，离心除去沉淀。

取清液1ml，加入0.55M碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于370C水浴显色15分钟，在680nm波长下比色，测光密度（OD）。

以光密度读数为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制曲线。

（2）样品测定

样品测定设对照管和测定管。

                               对照管          测定管

适当稀释酶溶液                   /               1ml

去离子水                       1ml               /

                 370C水浴预热3---5分钟

0.5酪素（预热过）             2ml                2ml

                  370C水浴准确反应15分钟

10％三氯乙酸                   3ml               3ml

离心去除沉淀

取上清液于另外试管内            1ml              1ml

0.55M碳酸钠                    5ml              5ml

福林试剂                        1ml              1ml

37℃水浴显色15分钟，680nm波长比色，以对照管校零，读取测定管光密度。

3、计算

在37℃下每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位

蛋白酶的活力单位＝A/15×F

A为样品测得光密度查曲线，得相应酪氨酸μg数

F为酶液最终稀释倍数，15为反应时间（min）

[方法评估]

福林—酚法测定蛋白酶活力是生产实践和科学研究中应用的基本实验方法。

[应用意义]

水产动物消化系统内的消化酶随动物种类而异，而且消化酶的种类和在消化道中分布的差别是和动物食性相适应的。

分析消化蛋白酶活力有助于了解动物对蛋白质食物的消化能力，掌握动物的营养需求。

[注意事项]

1、实验材料应新鲜，不新鲜会发生组织自溶和酶原被破坏。

2、酶液与底物作用时间、作用温度要严格控制，否则数据误差很大。

3、酶液要用适当缓冲液稀释到测定光密度在0.2—0.6之间。

淀粉酶活力的测定

[目的与原理]

掌握淀粉酶活力的测定方法，测定水产经济动物的主要消化器官肝胰脏、胃、肠内的淀粉酶活力。

淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖等。

在基质充分的条件下，反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较其吸光度，从而推算出淀粉酶的活力单位。

[试剂与器材]

试剂：

1、0.04%可溶性淀粉

精确称取可溶性淀粉0.20g，置于20ml烧杯内，加入蒸馏水约5ml，摇匀使成淀粉混悬液，另称取无水磷酸二氢钠13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500ml烧杯内，加入蒸馏水约250ml,煮沸后，将淀粉混悬液倒入此烧杯内，并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数次，洗涤亦倒入此烧杯内。

继续煮沸1分钟，冷却至室温后倒入500ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至500ml刻度。

此淀粉液pH应为7.0±0.1，在室温下保存2―3个月。

2、0.1N碘贮存液：

精确称取碘酸钾（KIO3）3.567g及碘化钾（KI）45g置于1L容量瓶内，加入蒸馏水约800ml，然后缓慢加入浓盐酸9ml，摇匀后用蒸馏水稀释至1L刻度，置冰箱内备用。

3、0.01N碘应用液：

取0.1N碘贮存液50ml，用蒸馏水稀释至500ml，盛于棕色瓶中置冰箱内约保存1个月。

材料：

新鲜鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。

器材：

分光光度计、电子天平、离心机、pH测定仪，恒温水箱、匀浆器、剪子、镊子、冰块、50ml比色管若干、移液管若干，500ml容量瓶，烧杯。

[实验步骤]

1、酶提取液的制备（见实验蛋白酶活力的测定）

2、淀粉酶活力的测定

取50ml刻度比色管二只，标明为对照管，测定管。

对照管

测定管

0.04％可溶性淀粉

5.0ml

5.0ml

将两管在37℃水浴中预热2—5分钟

酶液

—

0.1ml

测定管混匀后，再置37℃水浴中反应7.5分钟

0.01N碘应用液

5.0ml

5.0ml

用蒸馏水稀释至50ml，立即混匀。

用660nm或红色滤光板进行比色，以蒸馏水校正光密度0点，读取对照管和测定管光密度读数。

3、计算

淀粉酶活力单位定义：

在370C、30min内，100ml酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10mg称为一个淀粉酶活力单位。

淀粉酶活力单位/100ml＝（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×2/10×30/7.5×100/0.1=（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×800

[方法评估]

测定淀粉酶的方法有很多种，大致可分为两类：

即测定底物（淀粉）的减少量和测定产物（如还原性糖）的生成量。

本实验采用前者的淀粉—碘比色法。

[应用意义]

分析淀粉酶的活力有助于了解水产动物对食物中淀粉的消化能力，由于鱼虾等水产动物种类与大小的差异和所提供食物品质的不同，以及动物所处生活环境的变化，各种水产动物对食物的消化吸收有明显的差别。

认识鱼虾消化酶变化特性，为研究水产种类饲料配伍提供科学依据

[注意事项]

1、0.04%可溶性淀粉溶液5ml内含淀粉量为2mg，在本法条件下，当2mg淀粉完全水解时相当于800淀粉酶单位／100ml（即：

2/10×30/7.5×100/0.1=800）。

2、对照管内含淀粉2mg，由于淀粉溶液比较稳定，故对照管在固定比色计上的光密度读数并不改变，因而在测定中不必每次作对照管。

3、当淀粉酶接近800单位时，由于淀粉已几乎完全被水解，故加入碘液后也不再显蓝色，因此淀粉酶单位较高时（接近600单位）宜将标本稀释（2～5倍）后重新测定，并将测定结果乘以稀释倍数。

4、如淀粉溶液出现混浊或絮状物，表示淀粉溶液污染或变质，不能再用。

5、唾液内含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飞沫污染，也能使测定结果显著偏高。

脂肪酶活力的测定

[目的与原理]

掌握脂肪酶活力的测定方法，并测定鱼、虾、贝体内消化器官肝胰脏、胃、肠的脂肪酶活力。

脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解。

在不同水解阶段可分别产生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。

水解所产生的脂肪酸可以用标准的氢氧化钠滴定，用滴定值表示酶活力。

[试剂与器材]

试剂：

1、聚乙烯醇（P.V.P.）橄榄油乳化液：

称取40克聚乙烯醇，加蒸馏水约1000毫升，在小火上加热，并不停搅拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷却后定容至1000毫升。

用双层纱布过滤，滤液备用。

取4％聚乙烯醇溶液150毫升，加50毫升橄榄油，用高速组织捣碎机搅动6分钟，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液，保存于低温下（4℃）备用。

2、0.025M磷酸缓冲液（pH7.5）。

0.025M磷酸氢二钠溶液的配置：

取Na2HPO4·2H2O4.45g溶于1L蒸馏水中，0.025M磷酸二氢钠溶液的配置：

取NaH2PO4·H2O3.45g（或NaH2PO4·2H2O3.90g）溶于1L蒸馏水中。

将0.025M磷酸氢二钠84ml与0.025M磷酸二氢钠16ml混合，即为0.025M磷酸缓冲液。

3、0.05N氢氧化钠标准溶液

4、1％酚酞指示剂：

取1g酚酞溶于100ml70％乙醇溶剂中。

5、95％乙醇

材料：

鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。

器材：

匀浆器、离心机、恒温水浴。

高速组织捣碎机、酸式滴定管、滴定管架、镊子、剪子、锥形瓶、移液管、烧杯。

[实验步骤]

1、酶粗提液的制备（见蛋白酶活力的测定）。

2、取100ml锥形瓶3个，一个作为对照组，另两个为测定组            

                            对照组     测定组1     测定组2

0.025M磷酸缓冲液（pH7.5）     5ml        5ml          5ml

聚乙醇橄榄油乳化液            4ml         4ml          4ml

95％乙醇                                 15ml          

                              40℃水浴预热5—10分钟

酶液                          1ml         1ml          1ml

                          40℃水浴保温15分钟（精确计时）

[方法评估]

测定脂肪酶活力的方法大致可分为3类：

即测定产物（游离脂肪酸）的增加量（如滴定法、比色法、分光光度法、荧光法和pH电极法等）；测定底物的减少量（如比浊法、扩散法等）；测定脂酶的实际量（如放射免疫法和乳胶凝集法等）。

本实验用滴定法测定脂肪酶活力，此法灵敏度较差，样品用量大，但所需设备较简单，可随时进行检测。

[应用意义]

脂肪酶是动物消化脂肪的重要酶类其分泌量和活力与动物对脂肪的消化、吸收、利用有关。

水产动物肝胰脏或胰脏是脂肪酶的主要分泌器官，胃肠粘膜及肝脏亦能分泌，有的鱼类幽门垂中脂肪酶活力最高。

测定水产动物各部位脂肪酶活力有助于研究、分析其对脂肪的消化能力及各部位消化功能状况。

[注意事项]

1、使用聚乙烯醇的聚合度为1000－1750，如聚合度低，乳化效果差。

橄榄油乳化液在冰箱中保存三天左右仍能保持稳定。

2、反应终了加乙醇可停止酶作用和溶解脂肪酸，以利滴定，乙醇用量以不低于总容量60%为宜。