基因工程复习题Word文档格式.docx

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7.下列有关连接反应的叙述，错误的是（A）

A.连接反应的最佳温度为37℃

B.连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于10%

C.连接反应缓冲体系的ATP浓度不能高于1mM

D.连接酶通常应过量2-5倍

8.T4-DNA连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA片段连接在一起，其底物的关键基团是（D）

A.2'

-OH和5'

–PB.2'

-OH和3'

-P

C.3'

–PD.5'

9.载体的功能是（I运送外源基因高效进入受体细胞II为外源基因提供复制能力III为外源基因提供整合能力）（D）

A.IB.I+IIIC.II+III

10.克隆菌扩增的目的是（I增殖外源基因拷贝II表达标记基因III表达外源基因）（D）

A.I+IIB.I+IIIC.II+III

11.下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的是（C）

A.大肠杆菌－繁殖迅速B.枯草杆菌－分泌机制健全

C.链霉菌－遗传稳定D.酵母菌－表达产物具有真核性

12.考斯质粒（cosmid）是一种（B）

A.天然质粒载体

B.由λ-DNA的cos区与一质粒重组而成的载体

C.具有溶原性质的载体

D.能在受体细胞内复制并包装的载体

13.某一重组DNA（6.2kb）的载体部分有两个SmaI酶切位点。

用SmaI酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子，其长度总和与已知数据吻合，该重组分子插入片段上的SmaI酶切位点共有（D）

A.4个B.3个C.2个D.至少2个

14.外源基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达的优点是（I融合基因能稳定扩增II融合蛋白能抗蛋白酶的降解III表达产物易于亲和层析分离）（D）

A.IIIB.I+IIC.I+IIID.II+III

15.提高重组率的方法包括（I加大外源DNA与载体的分子之比II载体分子除磷III连接酶过量IV延长连接反应时间）（A）

A.I+IIB.I+II+IIIC.I+III+IVD.II+III+IV

16.识别基因序列不同，但酶切后产生的粘性末端相同的一类酶为（B）

A.同工酶B.同尾酶C.同裂酶D.同位酶

17.pBR322质粒作为基因克隆载体应有下列何种调控元件（ABD）

A.AmPr和TetrB.ori复制子C.LacZ标记D.多克隆位点

18.λ噬菌体外包装目的基因片段的大小应为（D）

A.小于λ噬菌体DNA的50%B.小于噬菌体DNA的75%

C.大于λ噬菌体DNA的105%D.为λ噬菌体DNA的75%～105%

19.DNA连接酶的功能是（AB）

A.恢复3’-OH与5’-P之间的磷酸二酯键B.恢复缺口

C.恢复裂口D.可使平末端与粘性末端连接

20.PUC质粒作为基因克隆载体应有下列何种调控元件（ABCD）

A.AmPrB.ori复制子C.LacZ标记D.多克隆位点

21.下列属于获取目的基因的方法的是（D）

①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取

③从受体细胞中提取④利用PCR技术

⑤利用DNA转录⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥

22.的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是B

A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性

B．有利于对目的基因是否导入进行检测

C．增加质粒分子的分子量

D．便于与外源基因连接

23.有关基因工程的叙述正确的是D

A．限制酶只在获得目的基因时才用

B．重组质粒的形成是在细胞内完成的

C．质粒都可作为运载体

D．蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料

24.哪项不是基因表达载体的组成部分（B）

A.启动子B.终止密码

C.标记基因D.目的基因

25.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法（B）

A．基因枪法B．显微注射法

C.农杆菌转化法D．花粉管通道法

26.以下说法正确的是（C）

A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列

B、质粒是基因工程中唯一的运载体

C、运载体必须具备的条件之一是：

具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接

D、基因控制的性状都能在后代表现出来

27.不属于质粒被选为基因运载体的理由是（D）

A、能复制

B、有多个限制酶切点

C、具有标记基因

D、它是环状DNA

28.有关基因工程的叙述中，错误的是（A）

A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来

B、限制性内切酶用于目的基因的获得

C、目的基因须由运载体导入受体细胞

D、人工合成目的基因不用限制性内切酶

29.有关基因工程的叙述正确的是（D）

A、限制酶只在获得目的基因时才用

B、重组质粒的形成在细胞内完成

C、质粒都可作为运载体

D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料

30.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。

在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（C）

A、人工合成目的基因

B、目的基因与运载体结合

C、将目的基因导入受体细胞

D、目的基因的检测和表达

31.下列获取目的基因的方法中需要模板链是（B）

A.从基因文库中获取目的基因

B.利用PCR技术扩增目的基因

C.反转录法

D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成

32.下列有关基因工程的叙述中，错误的是AC

A、DNA连接酶将粘性末端的碱基对连接起来

B、基因探针是指用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子

C、基因治疗主要是对有缺陷的进行修复

D、蛋白质中氨基酸序列可为合成目的基因提供资料

二、是非判断题

1.DNA连接酶是一种能催化二条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，因此该酶既可修复基因序列中的缺口，也可修复裂口。

（×

）

2.质粒提取后，在琼脂糖电泳出现一条带时说明质粒提取纯度高，当为三条带时为纯度不高。

（×

3、入噬菌体的插入型载体只有一个单一限制酶切点，替换型载体有2个成对的限制性酶切点。

（√）

4、原核细胞和真核细胞转录的mRNA均具有与rRNA结合的SD序列，以利于进行有效的转录。

（×

5、cDNA文库是包含有细胞中所有mRNA，因此该文库能包含细胞所有的遗传信息。

（X）

三、填空题

1、在LacI标记基因插入外源基因，经IPTG诱导，在X-gal培养基中显白色，为阳性克隆，未插入基因的克隆显蓝色，为阴性克隆。

2、理想的质粒克隆载体应具备以下基本条件，如能自主复制、一种或多种限制酶的酶切位点、筛选标记、分子量小易拷贝。

3、点突变的基因系列在碱基替换中，若为一个嘌呤换成另一个嘌呤或一个嘧啶换成另一个嘧啶者称转换，若一个嘌呤换成一个嘧啶或一个嘧啶换成一个嘌呤者称颠换。

4、基因表达的四大表达系统分别为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞。

5、基因与载体的平末端连接方法有哪些T4连接酶连接法。

末端核苷酸转移酶加同聚物尾巴后，再用DNA连接酶进行连接；

化学合成衔接物后连接DNA分子。

6、如何利用抗性标记基因筛选阳性克隆？

抗性标记筛选；

抗性基因插入失活筛选；

LacZ基因失活筛选。

7、核酸操作的基本技术有哪些①核酸提取与纯化②核酸的检测与保存③核酸的凝胶电泳④核酸分子杂交

8、基因工程所需的基本条件1、用于核酸操作的工具酶；

2、用于基因克隆的载体；

3、用于基因转移的受体菌或细胞。

9、Klenow酶在有dNTP情况下，呈现DNA聚合酶活性，在没有dNTP情况下呈现外切酶活性。

10、利用PCR技术扩增目的基因

①概念：

PCR全称为_____聚合酶链式反应__________，是一项在生物__体外__复制____特定DNA片段___的核酸合成技术

②原理：

__DNA复制________

③条件：

_____已知基因的核苷酸序列______四种脱氧核苷酸______一对引物______、

_____DNA聚合酶____________________.前提条件：

④方式：

以_指数____方式扩增，即__2n__（n为扩增循环的次数）

⑤结果使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增

11．PCR技术扩增过程

a、DNA变性（90℃-95℃）：

双链DNA模板

在热作用下，氢键断裂，形成____单链DNA

b、复性（55℃-60℃）：

系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部__双链______。

c、延伸（70℃-75℃）：

在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的__DNA链______。

四、名词解释

1.同尾酶某些限制性内切酶识别的碱基顺序不同，但酶切后产生同样粘性末端的两种酶

2.柯斯（C0S）质粒带有λ噬菌体的COS位点和整个pBR322的DNA顺序的大肠杆菌质粒。

3.SD序列为mRNA能在细菌核糖体上产生有效结合和转译的特殊序列。

4.质粒不亲和性：

在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存的现象。

5.cDNA文库：

是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合。

6.穿梭质粒载体：

指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。

7.基因（gene）具有特定功能的DNA片段，这些片段有的编码蛋白质，有的编码rRNA、tRNA，有的则是与复制、转录调控有关的DNA序列。

8.基因重组:

由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。

9.基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。

是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的新的生物类型和生物产品

10.目的基因（objectivegene）：

又叫靶基因（targetgene），是指根据基因工程的目的,设计的所需要的某些DNA分子片段，它含有一种或几种遗传信息的全套密码（code）

五问答题

1.真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？

能，为什么？

不能，为什么？

不能，因为原核细胞缺乏对真核基因中内含子的剪接功能和转录后加工系统。

原核生物必须有相应的原核RNA聚合酶可识别原核细胞的启动子,以催化RNA的合成。

基因表达是以操纵子为单位，操纵子由数个相关的结构基因和调控功能的部位组成的。

因此在构建原核表达载体时必须有1个强的原核启动子及其两侧的调控序列。

2.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？

目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶（如EcoRI）消化酶切后,两者的两端均具有相同的粘性末端,称为单酶切点的粘性末端,又称全同源性粘性末端

⑴高背景

载体经单一限制性核酸内切酶切割后,载体分子易于自我环化,既不利于目的基因的重组连接,大大降低阳性克隆效率,又可使非重组性载体造成高背景。

为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5’-P以抑制DNA的自我环化。

在连接反应中,具有5’-P，的目的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性末端发生互补连接,尽管产生的重组DNA分子于连接点含有两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环,但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复。

⑵双向插入

经单一限制核酸内切酶（如EcoRI）切割的目的基因和载体,因二者的粘性末端是相同的,因此在连接反应中,目的基因可发生双向插入,载体对目的基因表达是有方向的,而目的基因可双向与之相连,这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响,若以表达为目的,我们就要对插入的片段进行方向鉴定,因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的,一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的mRNA。

若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组,以便定向克隆。

3.将外源性DNA克隆到β-LacZ区段的插入型噬菌体上后，如何筛选重组噬菌体？

β-半乳糖苷酶失活的插入型载体，在其基因组中含有一个大肠杆菌的lacZ区段，此区段编码有β-半乳糖苷酶基因lacZ，在诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）存在下，β-半乳糖苷酶能作用X-gal（5-溴-4-氯3-吲哚-β-D-半乳糖苷）形成蓝色化合物（5-溴-4-氯靛蓝）。

这样由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌（lac基因缺陷菌），涂布在补加有IPTG和X-gal的培养基平板上，会形成蓝色的噬斑，但若在lacZ区段上插入外源DNA片段，就会阻断β-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，这种λ重组体感染的lac-指示菌由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑，相反未发生外源基因插入则出现蓝色噬菌斑，以利筛选。

4.基因与载体的平末端连接方法有哪些？

简要或图示说明均可。

（1）T4DNA连接酶法

连接平末端DNA分子的方法有2种，一种是直接用T4连接酶连接，另一种是先用末端核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接。

T4DNA连接酶同一般的大肠杆菌DNA连接酶不同。

T4DNA连接酶除了能够封闭具有3’-OH和5’-P末端的双链DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高浓度酶的条件下,它还能够连接具有完全配对碱基的平末端DNA分子,但其连接效率比粘性端要低的多。

（2）同聚物加尾法

运用末端核苷酰转移酶，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3’-OH基因上,它并不需要模板链的存在,它一个一个加上核苷酸,构成由核苷酸组成的尾巴,长度可达100个核苷酸。

5.如何从所克隆到基因重组体中鉴定目的基因的存在和正确性？

根据插入基因的遗传性状进行筛选

只有当已知需克隆基因所编码蛋白质的功能,且该蛋白质又为细菌的生命活动所必需时,即可用该方法筛选。

如：

已知蛋白质中的亮氨酸（Leu）为Leu营养缺陷菌所必需,当外源目的基因可表达亮氨酸,将该基因的重组子转入Leu缺陷菌中,在不含亮氨酸的基本培养基平板中,只有重组子表达的亮氨酸才能被Leu缺陷菌所利用而能生长繁殖,形成菌落。

因而能生长的细菌集落，均为阳性的重组子克隆，而无该重组子的Leu缺陷菌在不含亮氨酸的平板上则不能生长，不能形成菌落。

根据重组子的结构特征筛选

（1）.重组子大小鉴别筛选

重组子中因装有一段较大分子量的外源基因DNA,因此其分子量明显比原载体大得多,因此可从平板上挑取菌落分别提取重组载体（如质粒重组子）和原载体（质粒），无需用限制性内切酶消化，直接进行凝胶电泳，携带外源性目的基因的重组子质粒因分子量大，电泳迁移率较小，其电泳条带在后，而原载体质粒因分子量较小，电泳迁移率较大，其电泳条带在前。

通过比较可初步判断重组子中是否插入外源基因片段。

本方法适用于插入片段较大的重组子的初步筛选。

（2）.酶切鉴定

对于筛选出的具有重组子的菌株，应经小量培养后，再分别提取原载体或重组体载体（重组质粒或重组噬菌体DNA），根据已知重组时外源基因两端的酶切位点，分别用相应的两种内切酶进行酶解，经琼脂糖电泳后，原载体因无外源性目的基因，切开后变成线性，电泳呈一条带，若载体上有外源性目的基因插入，切开后电泳出现两条带：

一条为载体质粒线性条带，一条为释放出的插入基因片断的小分子条带，这样就可以看出载体中是否有插入的目的基因片断，以及由DNAmarker条带对比分析可得知插入基因片段的大小

（3）.目的基因序列测定

6.基因工程诞生的理论基础是什么？

是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。

理论上的三大发现：

①证实了DNA是遗传物质

②揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理

③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定

技术上的三大发明：

①限制核酸内切酶的发现与DNA切割

②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接

③基因工程载体的研究与应用

7.如何有效地提高外源基因的表达效率？

⑴提高启动子强度⑵缩短启动子同克隆基因间距离⑶高效的翻译起始序列⑷高效的转录终止区⑸提高质粒拷贝数及稳定性⑹用以下方法提高翻译水平：

①调整SD序列与AUG间的距离②用点突变的方法改变某些碱基③增加mRNA的稳定性的⑺减轻细胞的代谢负荷：

①诱导表达②表达载体的诱导复制⑻提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：

①克隆一段原核序列，表达融合蛋白②采用某种突变菌株③表达分泌蛋白质

8.大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？

优点：

大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。

缺点：

在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；

许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；

外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。

9.什么是α-互补筛选？

质粒载体具有β-半乳糖苷酶基因（lacZ），当外源DNA插入到它的lacZ，可造成表达后的β-半乳糖苷酶失活，利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。

有些大肠杆菌上带有lacZ基因的部分编码序列，质粒载体中含有别一部分编码序列，当质粒转入载体后，可形成具有酶活性的蛋白质。

这种lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫α互补。

10.真核细胞基因结构和原核细胞的有何相同点和不同点？

1）相同点：

都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成。

2）不同点：

原核细胞基因的编码区是连续的，真核细胞基因的编码区是间隔的，不连续的。

11.基因克隆常用的载体必须具备的基本条件？

⒈具有独立复制能力

⒉具备多个限制酶的识别位点（多克隆位点）

⒊具有遗传表型或筛选标记

⒋有足够的容量以容纳外源DNA片段

⒌可导入受体细胞。