中国药科大学本科毕业论文Word文档格式.docx
《中国药科大学本科毕业论文Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中国药科大学本科毕业论文Word文档格式.docx（29页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
首先，通过HPLC法对金线莲黄酮苷成分进行分析定量，再通过对金线莲单因素提取方法（索氏提取、回流法、超声提取、冷浸法、温浸法），乙醇和甲醇提取溶剂的差异，提取溶剂含量和体积的差异，不等的提取时间以及不同的提取温度的考察，从中选取重要影响因素（提取温度、提取时间、溶剂含量和料液比）和最优点，制定正交试验表。
按照正交试验表所制定的实验条件，在375nm波长下进行UV法直接测定黄酮含量，获得数据，对数据进行处理，制作方差分析表和极差分析表。
结果：
提取温度、提取时间、溶剂含量和料液比对金线莲总黄酮含量影响显著，其中影响因素大小为溶剂含量>
提取时间>
料液比>
提取温度。
结论：
该法能准确地对金线莲黄酮类含量进行分析，准确快速。
关键词：
金线莲；
总黄酮；
提取方法；
StudythedeterminationmethodoftotalFlavonoidsfromAnoectochilusroxburghii
Abstract：
Objective:
ToresearchthesuitableforextractionmethodinAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.inordertothedevelopmentofAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.researchandtatolflavonoidsextractionofAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.inthelaboratoryandprovidetherelatedexperimentdataandideas.
Methods:
First,analyzingtatolflavonoidsingredientsquantitativeofAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.byHPLC,throughsinglefactorextractionmethodsofAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.（soxhletextraction,refluxextraction,ultrasonicextraction,coldsoakextraction,warmimmersionextraction）,thedifferenceofethanolandmethanolextractionsolvents,thecontentoftheextractionsolventandthedifferencesinvolume,theexplorationofextractiontimeandextractiontemperature,choosingtheimportantinfluencefactors（extractiontemperature,extractiontimeandsolventcontentandtheratioofmaterialandliquidthe）andthemostadvantage,andformulatingorthogonaltesttable.Accordingtoorthogonaltesttableoftheexperimentalconditions,determinatingdirectthecontentsoftatolflavonoidsunderthe375nmUV-Visspectrophotometry,andgettingthedataanddisposingofthedata,analysisingofvariancetableandextremingdifferenceanalysistable.
Results:
Extractiontemperature,extractiontime,solventcontent,andtheratioofmaterialandliquidtheonthetotalflavonoidsofAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.effectsignificantly,thefactorsaffectingthesizeforthesolventcontent>
extractiontime>
theratioofmaterialandliquidthe>
extractiontemperature.
Conclusion:
Themethodcanaccuratelyanalyzethecontentoftatolflavonoidsinlotus,fast.
Keywords:
Anoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.;
Totalflavonoids;
Extractionmethod;
前言
金线莲（Wall.）Lindl.Anoectochilusroxburghii为兰科开唇兰属珍稀濒危药用植物，又名金线兰、花叶开唇兰等，民间素有“药王”、“金草”之美誉[1]，在我国福建、广西、广东、云南和台湾等省份都有分布，具有清热凉血、祛风利湿、降血压等功效。
全国最大的金线莲产区是福建省，其产区规模正在逐渐扩大，已成为福建特色中草药之一。
金线莲具有很好的药用价值，民间多用于治疗糖尿病、高血脂、乙型肝炎等疾病，由于繁殖率低、生长环境独特、鸟类嗜食等原因，野生金线莲资源日渐枯竭，随着其功效应用的扩大，需求量不断增大，人工培育的金线莲已日渐形成规模[2]。
金线莲中主要成分有黄酮类化合物、甾体类化合物、三萜类化合物、生物碱、糖类、氨基酸、微量元素等，其中黄酮类化合物有槲皮素、异鼠李素、山奈酚，甾体类化合物有豆甾醇、开唇兰甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇等，三萜类化合物有木栓酮、琥珀酸、阿魏酸、胡萝卜苷、香豆酸、熊果酸、棕榈酸、齐墩果酸等。
自然界存在于金线莲中的总黄酮成分，大部分与葡萄糖或鼠李糖结合成糖苷，少量的为鞣质或游离态存在，所以简单的加乙醇并不能将黄酮类化合物提取出来，故在加提取溶剂的同时，加少量的盐酸，促进黄酮类化合物水解出峰。
黄酮化合物一般具有基本骨架结构C6-C3-C6。
目前，对黄酮类化合物的研究国内外已比较深入，其定量方法常用HPLC法和UV法，在生产和科研中，对黄酮单体定量常用HPLC法；
HPLC法测黄酮含量，根据文献资料甲醇-水-磷酸（52:
48:
0.04）但峰间距小，不易画基线，对比例进行了调整，随着甲醇比例的减小，峰间距加大分离度加大[3]。
而对于总黄酮的测定，因为UV法具有准确、重复性好、易掌握等优势，所以该法用于测定总黄酮含量最为普遍。
UV法常用法有直接测定法和显色测定法。
直接测定法是不使用显色剂，根据黄酮自身结构，直接在其特征吸收峰出测定，该方法对于单成分样品测定准确、简便、快速;
但对于中草药来说，杂质干扰大，出现误差可能性大，常采用的是碱性条件显色测定法，一般认为直接测定弱于显色测定的结果，且皂苷、多糖对试验均无干扰，但对于此次的紫外测定金线莲则由于植物自身原因，而选择了直接测定法测定总黄酮含量。
对金线莲进行现代应用研究自1990年后才开始，主要集中在组织培养、人工种植、化学成分和药理作用的研究。
《中国药典》中尚未对金线莲进行收载，故做此实验不仅完善金线莲的实验室提取工艺，而且对金线莲在药典中的收载做出些参考。
第一章材料
1.1药物和试剂
槲皮素（批号100081-200907,含量96.5%）购自中国食品药品检定研究院；
山奈酚（批号110860-201109,含量99.0%）购自中国食品药品检定研究院；
异鼠李素对照品（批号110861-200808,含量95.9%）购自中国食品药品检定研究院；
甲醇、乙醇、磷酸均为分析纯；
水为超纯水；
1.2主要仪器
Agilent1100液相色谱仪（安捷伦公司）；
HH-6恒温水浴锅（国华电器有限公司）；
JY10002电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；
UV-2450紫外分光光度计（日本岛津公司）；
超纯水器（MiliQDirect8）。
1.3供试品
金线莲粉末（南平市人民医院提供）
第二章HPLC分析黄酮苷的成分
2.1色谱条件
色谱柱为GraceVisionHTC18（250mm×
4.6mm,5µ
m）,流动相为甲醇-0.04%盐酸（45：
55），流速为1mL/min，检测波长为374nm，结果见图1。
图1对照品（A）、供试品（B）高效液相色谱图；
1.槲皮素（Quercetin）；
2.山柰酚（Kaempferol）；
3.异鼠李素（Isorhamnetin）
B
A
2.2检测波长的选择
取槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品在205nm~600nm波长范围内进行扫描，结果显示槲皮素在256nm和375nm波长下有最大吸收波长，山柰酚在266nm和371nm波长下有最大吸收波长，异鼠李素在256nm和374nm下有最大吸收波长，见图2，由图2可知，三种物质在256nm-266nm,371nm-375nm波长范围内有最大吸收，371nm-375nm波长的吸收峰明显高于256nm-266nm波长，同时峰形好，且最大吸收波长相对较一致，故选择374nm作为测定波长。
图2对照品紫外扫描图谱
1槲皮素；
2山柰酚；
3异鼠李素；
2.3对照品品溶液的制备
精密称取槲皮素3.35mg,山柰酚4.41mg,异鼠李素7.33mg分别置25mL量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，分别得对照品储备液Ⅰ（槲皮素129.3µ
g/mL）、Ⅱ（山柰酚169.2µ
g/mL）、Ⅲ（异鼠李素289.9µ
g/mL），分别精密吸取上述3种溶液各1mL，置于10mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，即得混合对照品溶液（槲皮素12.93µ
g/mL、山柰酚16.92µ
g/mL、异鼠李素28.99µ
g/mL）。
2.4供试品溶液的制备
取样品约0.5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，精密加入甲醇25mL、盐酸1.5mL，于水浴中回流1.5小时，放冷，过滤，取续滤液，即得。
2.5线性关系考察
取混合对照品溶液，分别进样1µ
L、2µ
L、5µ
L、10µ
L、20µ
L，以质量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，结果见图3。
槲皮素、山柰酚、异鼠李素的线性范围分别为：
12.95~258.6ng;
16.92~338.4ng；
28.99~579.8ng。
图3混合对照品标准曲线
第三章紫外法测定总黄酮含量
3.1对照品的确定
对续滤液的NaNO2-Al（NO3）3-NAOH的显色处理后颜色比未显色续滤液浅，且发现金线莲相关文献内未有有芦丁的记载，故对槲皮素、山柰酚、异鼠李素进行紫外200nm-800nm的波长扫描，60%乙醇作为空白，三者波形相似，在256nm左右和375nm左右波长有最大吸收峰，处于易获得和低成本的考虑，选用槲皮素作为对照品。
3.2测定波长的选择
精密称取适量的槲皮素对照品，60%乙醇溶解，作为对照品溶液；
精密称取1.0g金线莲粉末，用60%乙醇50mL水浴回流3小时，在205~550nm波长范围内进行扫描，并导出测定波长的选择，结果见图4、5。
图4对照品零阶（A）、一阶（B）、二阶（C）导数光谱图
图5供试品零阶（A）、一阶（B）、二阶（C）导数光谱图
C
由图4可知，对照品在对照品在256nm和375nm处零阶图谱有最大值，一阶图谱过零点，二阶图谱分别有过零点和最小值，且振动有规律，得对照品在256nm和375nm处有最大吸收波长；
由图5可知供试品在256nm和375nm处零阶导数图谱有最大吸收值，一阶导数图谱分别有过零点和最小值，二阶图谱都有最小值但256nm点无振动规律，375nm点振动有规律，且256nm波长处检测波不稳定，故选择375nm作为最佳吸收波长。
3.3不同提取方法的考察
3.3.1不同提取方法对含量的影响
精密称取金线莲粉末1.0g,加60%乙醇提取，结果见表1和图6。
表1不同提取方法对含量的影响
方法
索氏提取法
回流法
超声提取法
温浸法
冷浸渍法
取样量/g
1.0001
1.0017
1.0019
1.0020
1.0004
WL375
0.225
1.291
1.042
1.164
1.084
WL256
0.54
0.519
0.392
0.437
0.404
溶剂含量
60%
提取时间
3小时
0.5小时
6小时
24小时
料液比
100
50
提取温度
每秒2-3滴回流.95°
每秒2-3滴回流,95°
20°
60°
图6不同提取方法的吸光度比较
由表1和图3可知，在不同提取方法提取条件达到较好的情况下，回流法的提取效果最佳，且从提取时间实际情况考虑，可作为实验室提取金线莲黄酮类成分的首选方法。
3.3.2溶剂类型和溶剂含量对吸光度影响的考察
精密称取金线莲粉末0.2g，置锥形瓶中，加浓度不等的乙醇和甲醇95°
C水浴回流2小时，放冷过滤，取续滤液3mL在25mL容量瓶中，60%乙醇稀释至刻度线，在紫外375nm和256nm测定吸收值,结果见表2、图7和表3、图8。
表2乙醇浓度对吸光度影响测试结果
乙醇浓度/%
0%
20%
40%
80%
100%
0.2043
0.2073
0.2001
0.2017
0.2039
0.2047
吸光值375nm
0.052
0.074
0.091
0.117
0.238
0.213
吸光值256nm
0.219
0.253
0.268
0.285
0.332
0.218
图7乙醇浓度对吸光度影响测试结果图
表3甲醇浓度对吸光度影响测试结果
甲醇浓度/%
0.1994
0.1995
0.1988
0.2021
0.2064
0.2030
吸光度256nm
0.217
0.276
0.522
0.318
0.301
0.302
吸光度375nm
0.043
0.090
0.161
0.112
0.111
0.243
图8甲醇浓度对吸光度影响测试结果图
由表2、图4和表3、图5可知，甲醇、乙醇浓度对提取液吸光度影响较大，乙醇浓度0-60%和甲醇浓度60-100%供试品吸光值基本保持不变，80%乙醇的最大吸收值和40%甲醇最大吸收值相近，而乙醇无毒易得，相比较下，乙醇比甲醇更适合作提取溶剂。
3.3.3料液比对含量影响的考察
精密称取金线莲粉末0.2g，用80%乙醇25mL水浴95°
C回流2小时，放冷过滤，取续滤液3mL置25mL容量瓶中，80%乙醇定容至刻度线。
375nm和256nm紫外分光光度法测定,结果见表4和图9。
表4料液比对含量影响的测试结果
溶剂体积/mL
10
20
30
40
60
0.2036
0.2005
0.2035
0.2067
0.651
0.47
0.374
0.308
0.207
1.278
0.733
0.5
0.402
0.267
图9料液比对含量影响的测试结果图
由表4和图6可知，随着料液比的增大，吸光度也在增大。
料液比在50-200之间，吸光度在逐渐上升，而其在200-300之间，吸光度保持基本不变。
3.3.4提取温度对含量的影响
精密称取金线莲粉末0.25g，用80%乙醇25mL加热回流2小时，放冷过滤，取续滤液3mL置25mL容量瓶中，80%乙醇定容至刻度线。
375nm和256nm紫外分光光度法测定，结果见表4和图10。
表4提取温度对含量影响的测试结果
提取温度/°
70°
80°
90°
100°
0.2465
0.2560
0.2545
0.2511
0.569
0.466
0.505
0.555
0.709
0.716
0.703
0.749
图10提取温度对含量影响的测试结果图
由表4和图7可知，温度从70-80°
C呈现下降的趋势，而温度从80-100°
C呈现的是上升的趋势，因此温度在70°
C为四个值中的最佳提取温度。
3.3.5提取时间对含量的影响
精密称取金线莲粉末0.25g，加80%乙醇25mL在100°
C水浴回流不等时间，在375nm和256nm紫外下检测吸光值，结果见表5和图11。
表5提取时间对含量影响测试结果
时间/h
1
1.5
2
3
4
0.2559
0.2561
0.2508
0.2476
0.2495
0.566
0.581
0.384
0.510
0.56
0.629
0.746
0.735
0.631
0.712
0.773
图11提取时间对含量影响测试结果图
由表5和图8可知，随着时间的变化0.5-1.5小时吸光值在下降，1.5-4小时吸光值在逐渐上升，在1.5小时处，为提取值最低点，提取时间和吸光度并未成比例关系。
从表看来，提取时间越久越好，但从实验室的效益和可行性来看，1小时为最佳提取时间。
3.4对照品的制备
精密称取槲皮素对照品11.98mg置25mL量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，得对照品储备液（槲皮素479.2µ
g/mL），精密吸取上述溶液1mL，置于25mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，即得对照品溶液（槲皮素19.17µ
3.5供试品的制备
精密称取金线莲粉末约0.2g，置锥形瓶中，精密加入80%乙醇60mL于100°
C水浴回流1小时，冷却，过滤，精密量取续滤液3mL置25mL量瓶中，80%乙醇稀释至刻度线，
另用80%乙醇做空白溶液,375nm波长测定总黄酮含量。
3.6标准曲线的制备
减量称量法称取1.2mg槲皮素置25ml容量瓶中，60%乙醇溶解并定容，分别吸取0mL,1mL,2mL,3mL,4mL,5mL,6mL置于25ml容量瓶中，用同溶剂定溶，定溶液做为空白溶液。
在375nm做标曲，结果见图12。
图12槲皮素标准曲线
第四章方法考察
4.1稳定性试验
取混合对照品溶液和样品溶液分别在0、2、4、8、16、24小时后HPLC测定含量，结果见表6,7，表明对照品和样品在24h内稳定。
表6混合对照溶液稳定性试验结果
组分
峰面积/mAu
平均值/mAu
RSD/%
槲皮素
545.76
538.74
1.54
541.75
542.23
6
540.14
8
542.31
16
538.41
24
520.61
山柰酚
613.98
604.83
1.24
611.35
612.45
601.32
600.11
升级会员 