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producedbymanytissuesandcelltypesin
varietyofinvertebrate,plantandanimalspecies.Theiraminoacidcomposition,amphipathicity,cationicchargeandsizeallowthem
to
attach
andinsertintomembranebilayers
formporesbybah'el—stave7.carpet
77
or
toroidal—pore
mechanisms.Thedifferentmod—
elsofantimierobial—peptide—inducedporeformationandcellkillinganddrug—fastmechanismswerepresentedinthisreview.Keywords:
antimierobialpeptides;
mechanisms;
pores
19世纪80年代早期,由分泌物、血液、粒细胞和淋巴组织分离的抗菌肽活性就已经被认知。
1920年至
是可被诱导的,趋化到感染的微生物表面,以此杀灭或降低被入侵的微生物的生长,来增强自然免疫力和获得性免疫力。
由此,抗菌肽的研究领域就诞生了。
不久,Hirsch从吞噬性粒细胞提取物中纯化到抗微生物物质,而且它们是与粒细胞混合物中的低分子量的阳离子混合物的出现相关联,主要包括提高杀菌,提高渗
透压蛋白。
2。
。
随后又分离并纯化到昆虫蛾血素、两栖动物马加宁和哺乳动物防御素。
3。
至今,已有880多
1950年间,从这些分泌物中分离的抗菌混合物活性研
究表明对革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G一)的
作用具有选择性。
这些混合物如鼻粘液中的溶菌物质
主要为碱性的抗菌蛋白和碱性线型组织多肽。
虽然一些较大的碱性蛋白被认为是组蛋白和鱼精蛋白的组成片段,但是一些小的组织多肽还没有被鉴定。
尽管如此,它们的特征、活性和作用模式是确定的:
抗菌碱性蛋白和多肽与细胞核蛋白或表面带负电荷的细菌或病毒结合,这样就打破了细胞的重要功能。
与带有负电荷细胞表面的碱性物质结合是通过静电结合来完成的。
11。
这些抗菌物质在正常的组织和体液中与自然抵抗力联合起来对微生物发挥作用已经很清楚了。
它们
种抗菌肽被鉴定或核酸序列被预告,包括多种无脊椎
动物,植物和哺乳动物的许多组织和细胞,某一细胞因子和化学激活剂,选择性神经肽和肽激素,较大蛋白的碎片产生的抗菌肽。
41。
抗菌肽被认为是一种治疗耐药菌感染或败血性休
克的可能的药物来源。
5。
在膜系统模型方面评价自然肽和肽类同系物活性机制的一些研究,结合同样的肽
收稿日期:
2009—03—08;
修回日期:
2009—05—29
作者简介:
黄现青(1977一),男,河南安阳人,博士,副教授,主要
从事微生物抗菌肽抗菌机理及其应用的研究,E—mail:
hxq8210@126.c01"11。
与微生物的类似研究有助于确定最佳肽活性参数。
在这篇文章中,展示了抗菌肽活性的几种不同模型,讨论其与抗菌肽诱导杀灭微生物机理的相关性。
抗菌肽能
够灭活核酸和细胞质蛋白,很明显,它也就是抗菌肽诱
62
万方数据
导杀灭微生物的机理。
1抗菌肽的多样性
抗菌肽是一种独特的、多结构特点的分子,根据它
们的氨基酸组成和结构又分为几种亚型。
6。
这些亚型
的选择性肽的NMR溶液结构见图1。
第一个亚型包括阴离子抗菌肽,这种类型比较小(721.6~823.8Da),一般来自表面活性提取物,支气管肺泡灌洗液和气管上皮细胞(图1a)。
它们以毫摩尔浓度出现,需要锌作为辅助因子,对G+和G均有抑制效果。
图1抗西肽的结构
Fig1Structuresofantimicrobialpeptides
第二个亚型包括大约290个阳离子肽,这些肽的肽链较短(少于40个氨基酸残基),缺少半胱氨酸,有时在中间有一个铰链或一个纽结(图lb)。
在水溶液中,许多肽结构混乱,但是在有三氟代乙醇、SDS的情
况下,磷脂小囊泡和脂质体或类脂质A分子的全部或部分会转移到仅螺旋区,使其结构变得比较规则。
仅一螺旋的含量和抗G+和G一的抗菌活性相关。
第三个亚型包括大约44个阳离子肽,这类肽富含特定的氨基酸(图lc)。
这一类型的菌血素(hacte—necins)和PR一39,富含有脯氨酸(33%~49%)和精氨酸(13%~33%)残基;
prophenin富含脯氨酸(57%)和苯丙氨酸(19%)残基;
indolicidin富含色氨酸残基。
这种肽多数是线型的。
第四个亚型包括阴、阳离子肽约380个,含有半胱
氨酸残基并有二硫链和稳定的B折叠(图1d)。
这一亚型包括从猪白细胞中分离的内源性抗微生物多肽和
防御素多成员家族。
最后,有一部分含有较大蛋白分子片段的阴离子
肽和阳离子肽。
这些片段具有抗菌活性,在组成和结构上与上面描述的抗菌肽相似。
然而,它们对先天免疫力的作用还不清楚。
关于抗菌肽活性机理研究,目前没有任何一种单一方法可以对抗菌肽活性机理给出充分的解释。
研究其活性机理的方法主要有:
显微镜技术、膜模型方法、荧光染色技术、离子通道技术、圆二色谱技术、固态一核
磁共振分析技术等。
2抗菌肽介导的细胞死亡过程
肽介导的细胞死亡是迅速的。
一些线性仪螺旋肽万方数据
杀灭细菌如此快以至于Boman报道它可以与细胞死亡的步骤相比。
其它的肽,如马加宁2、天蚕抗菌肽P1、PR一39和SMAP在15~90min可以杀灭细菌。
不管需
要多少时间或具体的抗菌机理,诱导杀灭细菌的步骤
一定是存在的,其导致细菌死亡的步骤主要包括以下
几个方面。
2.1
吸附
抗菌肽首先被吸附到细菌表面,一个明显的机制
就是阳离子肽或阴离子肽与细菌表面结构进行静电结
合。
研究表明像马加宁2和天蚕抗菌肽A很容易插入
到单细胞层,单层大泡脂质体和包括酸性磷脂在内的脂质体内。
然而,G一和G+比细胞膜模型更复杂,阳离子抗菌肽更容易第一个被吸附到存在于G外表面的净的负电荷附近。
例如,阴性磷脂和脂多糖的磷酸基,
容易和G+表面的磷壁酸结合。
人工合成的嵌合肽
(chimeric)如CEME与脂多糖和脂磷壁酸结合。
CEME相关的肽与脂磷壁酸结合的能力与它能够杀灭细菌并不相关,这表明抗菌肽可能与像细胞质膜这样的靶位
点相互作用而起杀菌作用的一1。
2.2附着
肽一旦接近微生物表面,在与外膜相互作用之前
它必须穿过荚膜多糖,G包括脂多糖,对于G+,在与
细胞质膜作用之前它必须穿过荚膜多糖、磷壁酸、脂磷
壁酸质类。
这一点是很重要的,但是在机理研究中是很少被阐述的。
肽一旦有机会进入细胞质膜它就能够
与脂双层相互作用。
在膜或小囊泡中把抗菌肽用单一的或混合的脂进行孵育的体外研究表明,肽以两种不同的物理状态进行结合。
在肽脂比较低的情况下,仪螺旋肽、B折叠肽、0转角插入到脂质头部限制细胞膜流动使之处于功能上的钝化状态。
膜变薄的程度是与
肽浓度成比例的。
与马加宁2、内源性抗微生物多肽和丙甲菌素相比,RTD一1使膜变薄的效果是显著降低
的‘8I。
2.3肽的插入和膜渗透性
在低肽脂比例的情况下,肽被结合与脂双层平行。
随着肽脂比例的升高,肽开始垂直向膜移动。
在高肽
脂比例的情况下,肽分子垂直移动并插入到双分子层中,形成跨膜孔洞(作为第一种状态)。
这种状态的肽
脂比随着肽和目的脂组成而发生变化,产生了许多假
设膜型来解释膜通透性增加。
在木桶式模型中(图2a),螺旋肽与中央空腔在细胞膜形成一个维管束,螺旋肽组成的桶状很像木桶一
样。
这种类型的跨膜孔洞是独特的,是由丙甲菌素定
向环状二色性,中子扩散诱导的,基于x一射线扩散的
63
同步加速器表明丙甲菌素采用仪螺旋构型附着、聚集并插入到含水蒸汽的定向双分子层中的。
疏水肽区域与脂双层的孔洞排列,疏水肽区域形成孔洞的内部。
易变的孔,使得其它的肽可以进入细胞膜。
最后,双分
子层弯曲打破之后分裂形成胶团。
2…。
在环孔模型中(图2c),抗菌肽螺旋插入到膜中诱
导脂单层持续弯曲通过孔洞以致于孔被插入的肽和脂质头部拉成线型。
这一类型跨膜孔洞是由马加宁类、
丙甲菌素诱导的跨膜孔洞包括3~11个平行的螺旋分子,内外直径分别为1.8nm和4.0nm。
孔壁是1.1nm,
大约是丙甲菌素螺旋的直径,根据木桶模型与8个丙
内源性抗微生物多肽类和蜂毒肽类多肽诱导的。
形成
环孔时,肽的极性头部与脂的极性头部相连结。
开口
甲菌素并排起来的尺寸一致。
然而,双分子层脂组成
的变化能调整肽聚集平衡和聚集的肽的数量一。
在地毯式模型中(图2b),脂聚集到双分子层表面。
这一模型可以解释像ovispirin一类平行移动到膜
处的肽从正常片层倾斜,然后与膜的两个小叶相连,从顶部到底部形成一个连续的弯曲,即环孔模型,孔被肽
和脂质头部拉成直线型,可能屏蔽和掩盖了阳离子肽
表面的抗菌肽的作用机理。
肽被静电吸引到阳离子磷
脂头部,像地毯一样大部分覆盖细胞膜表面。
高浓度
正电荷。
环孔模型像木桶模型那样肽总是与脂质头部
连接,甚至有时垂直插入到脂双层中。
否则在环孔模型中几个单体的出现将导致形成孔能量太高。
9。
肽时,表面定向肽像去污剂一样打破双分子层,最终导
致胶团的形成。
在临界浓度时,肽在膜表面形成环状
#*¨
==m
鬻酶汹
carpet
图2抗菌肽诱导杀灭微生物的桶一板模型(a)、螺管模型(b)和毯式(C)模型
Fig2Thebarrel—stave
model(A),toroidalmodel(B)andmodel(c)ofantimierobialpeptideinducedkilling
防御素机理还不确定,但是它们也渗透到膜双分
子层中,包括负电荷磷脂。
在二维脂双层内,当防御素
Bac7片断1~16,1~23和1~35并不能增加大肠杆菌
的渗透性,但是在有机体数量上可以降低2~5个数量
级。
稀释液的对侧处于负电势时HNP一1和兔NP一1形成一个跨膜孔洞。
在较大的单层囊泡内,NP一1在磷脂双分子层内形成一个较大的暂时性的缺损,NHP一2形成一个2.5nm的孔。
来自黑花蝇属terramovae的昆虫防御素A在细菌表面形成低聚物通道,可诱导钾泄漏。
来自褐尾麻蝇的毒虫畏在磷脂囊泡内形成低聚物。
毒虫畏与膜上的碱性疏水残基相互作用,然后与其它的毒
虫畏分子形成寡聚体而形成孔洞。
1…。
非膜外靶位点像抗菌肽影响自溶素和磷脂酶活
性。
自溶素溶血性葡萄球菌的N一乙酰胞壁酰一L一丙氨酸酰胺酶在细胞壁提取物中被脂磷壁酸和糖醛酸磷壁酸质抑制,加入阳离子肽酶后重新被激活,这也许就可
以用来说明处理的细胞的溶解。
1“。
虽然关于膜损害的描述是不同的,但它们之间可能是相互关联的。
离子通道,跨膜孔洞和大面积的膜破裂不能完全代表三个不同的作用模型,但它们之间
是连续完成的。
这一观点是和细胞生存能力丧失后超
微结构显示肽诱导的损害相关。
3细胞内杀灭模型
虽然离子通道,跨膜孔洞和大面积的膜破裂最终导致微生物细胞的溶解,但越来越多的推测认为这些影响并不是微生物杀灭的唯一机理。
越来越多的证据
表明细胞内有抗菌肽其它的作用靶位点(图3)。
早期
图3抗菌肽杀灭微生物作用途径模型
Fig3Themodelof
antimierobial
peptide-inducedkillingbydifferenttrack
肽一定要通过细胞质膜才能起到对细胞质独特的易位作用。
线性、带有脯氨酸链的仅螺旋肽丁二胍Ⅱ不能增加细胞质膜的通透性,但能渗透到细胞质膜中,
的研究表明抗菌肽活性的作用位点是可变的——如
64
并在细胞质内积聚。
这种肽易位的机理通过非细胞渗透肽丁二胍Ⅱ的脯氨酸链区域和马加宁2氨基酸末端
螺旋的融合来完成的,杂交肽很容易渗透到细菌细胞
质膜内并在细胞质内积聚共同完成抗菌活性。
另有研究报道,富含精氨酸的肽都很容易并高效地跨过细胞膜或核膜而发生易位。
在细胞质内,发生易位的蛋白能改变细胞质膜隔膜的形成,抑制细胞壁、核酸和蛋白质的合成,或抑制酶的活性。
硫醚抗生素从革兰氏阳性菌中分离的抗菌肽,它
包括硫醚氨基酸羊毛硫氨酸。
硫醚抗生素mersacidin
通过阻止膜的转糖苷作用而抑制肽聚糖的生物合成。
Mersacidin与脂质II结合抑制肽聚糖前体物(琥珀酸undecaprenyl一焦磷酸化酶一N一乙酰胞壁酸酯<促胸腺生成素32—36五肽>一N一乙酰葡糖胺<脂质II>)的聚△[13]
I:
zl
o
丁二胍II与大肠杆菌DNA和RNA结合,中国鲎
肽与DNA小槽结合来改变它们在1%琼脂糖中的电泳
速度。
ol螺旋肽(pleurocidin和dermaseptin),富含脯氨酸和精氨酸的肽(PR一39和indolicidin)、防御素(HNP一1)抑制胸腺嘧啶核甙、尿嘧啶核甙和亮氨酸在大肠杆菌中的吸收,由此可见,它们抑制了DNA,RNA和蛋白质的合成。
富组蛋白与真菌细胞膜上的受体结合,进入细胞质引起正常呼吸细胞的ATP非溶解性流失,也能够打
破细胞循环和导致活性氧类物种的再生。
短的富含脯
氨酸的抗菌肽也有几种不同的作用机理。
Pyrrhocori—cin,drosocin和apidaecinbind特异性地结合到一个
70KDa的热休克蛋白DnaK上,非特异性地结合到一个
60KDa的细菌分子伴侣GroEL上。
Pyrrhocoricin降低DnaK的ATP酶活性。
Pyrrhocoricin和drosocin能改变
错误折叠蛋白的重新折叠,这一现象表明结合的Pyr—
rhocoricin可以防止DnaK的结合肽袋结构域上多螺旋
盖的连续开放和关闭,并持续关闭空腔,抑制伴侣蛋白的折叠‘14]。
4耐药机理
微生物运用各种机制来抵抗抗菌肽的杀伤作用,
这些机理解释本文出现的几个观点是非常重要的。
这些机制与抗菌肽的粘附、肽插入和膜渗透性相对应。
在金黄色葡萄球菌中,包括基因dhA,dhB,dhC
和dhD的以≠操纵子通过将D一丙氨酸从细胞质运输到
表面磷壁酸来降低表面净的负电荷。
磷壁酸主链由于
含有磷酸基而具有高电荷,由于碱性氨基酸的加入,带有D一丙氨酸的脂化作用会引起净的负电荷的降低。
Dh操纵子的钝化作用增加了对防御素、内源性抗微生
物多肽和其它抗菌肽的敏感性。
金黄色葡萄球菌也能
通过MprF修饰带有L一赖氨酸的阴离子膜来编码赖氨
酰磷脂酰甘油(LPG)合成酶。
LPG是一种碱性磷脂,
是将赖氨酸一tRNA的L一赖氨酸转移到磷脂酰甘油上而形成的。
这样可以提高阳离子净电荷,很可能会使宿主防御肽不能发挥作用。
mprF突变体可能是通过嗜
中性粒细胞防御素起到杀伤作用,这表明其对金黄色葡萄球菌病原上的防御素的耐受具有一个中等的作用㈣。
革兰氏阴性菌通过阻止肽与外膜的粘附、脂多糖类脂质A的一部分的改变而使表面净的负电荷降低或
由于高数量的类脂质A酰基尾部的疏水性相互作用的
提高而使外膜流动性降低这些作用而降低对肽的敏感性(提高抗药性)。
荚膜多糖介导肺炎杆菌对乳铁蛋
白、鱼精蛋白硫酸盐和多粘菌素B产生耐药性。
荚膜
多糖限制肽与膜上靶位点的相互作用,肺炎杆菌株52K10,一个无荚膜突变株,要比临床上分离到的有荚
膜的肺炎杆菌株52145对肽有更高的敏感性。
氨基阿拉伯糖加入到类脂质A磷酸基中能降低阳离子抗菌肽和结合到葡糖胺Ⅱ第四号碳酯链上的负电
荷磷酸盐的相互作用。
2一羟基肉豆蔻酸盐和棕榈酸盐也能够被加入到类脂质A中,它可以通过高数量类脂质A酰基尾部之间的疏水性相互作用的提高而降低外膜的流动性。
已提高的疏水性的相互作用可以延缓或阻止肽的插入和孔的形成。
这些改变可以被S.typhi—murium和P.aeruginosa中的双组分调节系统PhoP—
PhoQ激活。
这一调节子包括一个传导激酶、辅酶Q、
一个转录激活因子和辅酶P,在感染或吞噬作用以后
细胞外钙、镁离子浓度,pH值或其它指标发生变化时,它随之表达。
对于S.typhimurium来说,这一系统能够
同时激活可遏制40多种不同的基因,像比较多见的辅酶P激活基因(pag/pqa)和辅酶P遏制基因(prg/pqr)。
PhoP—PhoQ调节PmrA—PmrB双组分的调节系统,依次控制pmrE/ugd和pmrFoperon基因操纵子的转录。
PmrA—PmrB介导P.aeruginosa在低镁离子浓度
下对多粘菌素B和阳离子抗菌肽产生耐药性并可以诱
导突变的脂多糖的修饰。
PhoP—PhoQ操纵子基因灭
活和突变体对抗菌肽敏感性的评价已证实基因和类脂
质A的修饰是产生耐药性的原因。
一些革兰氏阴性菌如Yersiniaenterocolitica,外膜蛋白的改变提高对抗菌肽的抗性。
产生抗性是由于抗菌
肽与一个名为pYVe分子量为70kb的质粒相关,这个
质粒可以编码Fenterocolitic外源凝集素A(YadA)、
F
enterocolitica脂蛋白A(YlpA)和Yop蛋白的产生。
65
耐药性或者与依靠ATP一结合盒载体运输肽进入细胞的能力有关或者与依靠抵抗小结节细胞分裂物流出泵外而将抗菌肽输出的能力有关。
两个机制都需能量和
肽活性载体。
上面描述的抗药性机理并不是所有的革兰氏阴性菌的耐药性机理。
越来越多的证据表明蛋白水解酶也
参与其中。
在体内,抗菌肽的蛋白水解酶是否起着耐药作用仍需进一步证明。
5肽活性和特异性基础
有关抗菌肽的特征,它们的来源和它们的活性范
围存在大量的报道。
虽然描述了很多肽结构和抗菌活
性的关系,但肽活性和其它特征方面显著不同的分子
基础报道很少。
例如,单一微生物对抗菌肽表面敏感性的不同表明大小、序列、结构域(如螺旋含量)、电
荷、整个的疏水性、两亲性和螺旋表面疏水性和亲水性
的宽度都非常重要。
另外的特征也是重要的,防御素
独特的羧基端立体异构体^y一环序列被鉴定,并发现其与抗菌肽活性有关。
在以前未被鉴定的肽中也发现了类似的环,像甜味剂brazzein和神经蝎毒素,并发现它们有抗细菌和真菌的活性。
改变上面的任何一个参
数,包括疏水力和带电残基的角度对换都能改变肽的
抗菌性和溶血性。
Tossi等强调的参数中的许多都是紧密关联的,改变一个参数就会导致其它参数的重大
变化。
因此开发理想的抗菌肽还是受一定限制的。
同样,微生物表面对单一肽敏感性的不同表明微
生物表面和细胞质膜的组成是同等重要的。
一定数量
的天然耐药性是与革兰氏阴性菌外膜的脂多糖分子的结构和组成相关的,也与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞质膜的磷脂有关。
膜质组成是重要的,细胞质
膜富含酸性磷脂的细菌对抗菌肽更敏感。
最后抗菌肽
活性和特征的有效性应考虑到体内的生理条件,包括
抗菌肽在感染部位的浓度,可能出现在组织和液体中协同物质的作用(如溶解酵素、其它抗菌肽和蛋白质的出现和二价阳离子的缺乏),可能出现的抑制物的作用
(如盐和血清蛋白的浓度)和在体内细菌复制的不正常特征,尤其是生物被膜中的那些不正常因素的出现。
总之,抗菌肽的不同和细菌表面、细胞质膜的不同
就是抗菌肽诱导细菌死亡的几个因素。
因此,有意识
的使抗菌肽形成跨膜孔将限制微生物亚型的出现。
然
而,抗菌肽除了细胞膜还有其它的作用靶位点,如乳铁
蛋白,通过条件性病原阻止生物被膜的生长,还有抗菌
肽与宿主的其它先天免疫分子有协同作用,如人的泪液分泌磷脂酶A,,它将有助于更有效,广谱的临床抗菌肽的发展、设计和合成。
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