VIGS小知识总结Word文档下载推荐.docx
《VIGS小知识总结Word文档下载推荐.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《VIGS小知识总结Word文档下载推荐.docx(2页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
当siRNA序列只同源于靶基因时,才可以用于下一步的基因功能研究。
5.为确保对靶mRNA的有效抑制,针对每一个靶基因应该设计4条以上siRNA序列,进行化学合成后,通过实验筛选出沉默效率最高的siRNA序列进行下一步的基因功能研究。
6.烟草(Nicotianabenthamiana)植株中八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase)基因PDS
GGCACTCAACTTTATAAACCCTGACGAGCTTTCGATGCAGTGCATTTTGATTGCTTTGAACAGATTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAACCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTGTGGAACATATTGAGTCAAAAGGTGGCCAAGTCAGACTAAACTCACGAATAAAAAAGATCGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAATGTTTTATACTGAATAATGGCAGTACAATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCACTCCAGTGGATATCTTGAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATCCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGCTAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCCATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAG
7.VIGS载体中对插入片段的方向并无要求,正义链方向及反义链方向的序列均可高效诱导基因沉默(Alkinsonetal.,1998;
Bruun-Rasmussenetal.,2007),但是对片段长度和序列特异性有一定的要求。
BothsenseandantisenseorientationsoftheinsertintheTRV2vectorhavebeenshowntoinvokesimilarVIGS.
8.用于VIGS的同源序列需要有较高的特异性,这样可以尽可能降低实验中的“脱靶”效应。
“脱靶”是指siRNA和非目的基因结合,导致非靶标基因沉默。
9.植物基因组中有大量的基因家族,家族间的基因序列相似性非常高,如果需要
特异性地沉默家族中的某个基因,则构建载体的同源片段必须适当的缩短长度以保持沉默的特异性。
10.siRNA设计原则
RNAi发挥作用的核心在于siRNA的序列结构,因此不同的siRNA导致的沉默效果差异非常巨大。
影响siRNA功能因素主要包括siRNA序列结构特点、靶向mRNA的空间结构、RISC与siRNA的相互作用、以及siRNA与mRNA错配。
目前siRNA设计的原则有两种方式:
(1)统计不同siRNA对靶序列抑制程度得到siRNA设计原则。
这个原则就是统计目前已有的siRNA序列,根据序列特点和序列沉默效果分析得到。
a.GC含量在30%-52%
b.有义链15-19位至少有3个A或者U
c.避免出现倒置重复,以防形成发卡结构
d.有义链的第3位核苷酸为A
e.有义链的第10位核苷酸为U
f.有义链的第19位核苷酸为A
g.有义链的第19位核苷酸不能为G或C
h.有义链的第13位核苷酸不能为G
(2)以siRNA序列上的能量为依据,筛选有效序列。
a.总的siRNA双联能量<
>
b.反义链5'
端的结合能<
c.有义链的5'
端结合能在5-9
e.GC含量在36%-53%
f.中间7-12位的结合能<
g.反义链5’端与正义链5'
端的能量差最好在-1~0
11.根据VIGS的作用机制,理论上引起目的基因沉默的最小插入片段为23bp,但是在实际操作中,23bp的核苷酸长度常常不能有效的启动目的基因沉默的发生,所以需要选择数倍于23nt的目的基因片段,但也不能过长。
为了使目的基因能够有效地沉默,通过实验表明200-500bp插入片段的沉默效果最佳。
当然,也可能存在其他影响沉默效果的因素,如目标基因序列的核苷酸组成、siRNA及目标序列的碱基对的热力学特性等。