白色念珠菌菌液制备Word文档格式.doc

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计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法技术规则报告菌数。

控制菌检查时可加大增菌液的用量。

离心沉淀集菌法：

取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有

沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约

2ml，加稀释液补至原量。

薄膜过滤法：

取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，过滤，冲洗吗，按薄膜过滤法测定其菌落数。

中和法：

选取适宜的中和剂消除供试品的抑菌活性后测定。

菌液组：

测定所加的试验菌数。

采用平皿法，

取试验用的

1ml

菌液

（约

50

～

100cfu

）

分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备

2

个平皿，按平皿法测定其菌

落数。

1.5 

试验组

平皿法：

取试验可能用的最低稀释级

供试液和

试验菌，

分别注

入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备

个平皿，按平皿法测定其菌落数。

1.5.2

培养基稀释法

（平皿法）

：

供试液分别注入

N

个平

皿中，每个平皿再注入

试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株

试验菌平均制备

1.5.3 

取规定量试验可能用的最低级供试液，过滤，冲洗，在最后一次

的冲洗液中加入

试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌落数。

至少要一张

膜。

1.5.4 

取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，如供试液含许多

药渣，先以

500

转

/

分钟离心

3

5

分钟，取全部上清液，再以

3000

分离心

20

分钟，

取下面

液体，

并用稀释剂洗地管底，

将洗涤液与

液体一起采用平皿法或薄膜过

滤法计数。

1.6 

供试品对照组

取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数（方法和试验组相同）

稀释剂对照组

若供试剂需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤法额、等处理时，应增加稀释剂对照

组。

用稀释剂代替供试品，

加入试验菌。

最终浓度为每

供试液含

，

按试

验组的供试液制备方法和技术方法计算。

回收率计算

试验组回收率计算

试验组的菌回收率=菌液组的平均菌落数数供试品对照组平均菌落验组的菌回收率-100% 

稀释剂对照组回收率计算

试验组的菌回收率

=

菌液组的平均菌落数

数

稀释剂对照组平均菌落

×

100% 

计数方法验证至少应进行

次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

1.9. 

在

次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落

数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的品均菌落数的百分率）≥

70%

，应采用自

然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这

些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，是试验组菌回收率大于

控制菌检验方法与验证

当建立药品的微生物限度检查时，

应进行控制菌检查方法的验证，

以确认所采用的方法

适合于该药品的控制菌检查方法测定。

若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检

验结果时，检验方法应进行重新验证。

验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

验证用菌株

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌为验证用菌株，菌株

传代次数不得超过5代。

菌液制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时；

分别取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成每1ml含菌数10～100cfu的菌悬液。

阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。

方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；

验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查方法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。

阴性对照菌不得检出。

常规法大肠埃希菌：

取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照组加入大肠埃希菌10～100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～

35

37

℃培养

18

24

小时，取此培养物按《微生物限度检测标准操作规程》

大肠埃希菌项下规定检查。

2.4.1.2 

大肠菌群：

取含适量（不少于

10ml

）的胆盐乳酸发酵培养基管

支，分别加

入含供试品

1g

或

、

0.1g

0.1ml

、含供试品

0.001g

0.001ml

的供试液，阳性菌

对照加入大肠埃希菌

10

，阴性菌对照计入近换色葡萄球菌

小时，按《微生物限度检测标准操作规程》大肠菌群项下规定检查。

2.4.1.3 

沙门菌：

取供试品

10g

，直接或处理后接种至适量（不少于

200ml

的营养肉汤培养基中，

用均浆仪或其他适宜方法混匀，

阳性菌对照加沙门菌

阴性菌对照加入近换色葡萄球菌

小时。

按《微生物

湖南金旺稀贵药业有限公司

GMP

管理文件

限度检测标准操作规程》沙门菌项下规定检查。

2.4.1.4 

铜绿假单胞菌：

取相当于

供试品的供试液至

100ml

胆盐乳糖培养基

中，阳性菌对照加入铜绿假单胞菌

，阴性菌对照加入大肠埃希菌

100cfu35

按《微生物限度检测标准操作规程》沙门菌项下规

定检查。

2.4.1.5 

金黄色葡萄球菌：

胆盐乳糖培养

基中，阳性菌对照加入铜绿假单胞菌

按《微生物限度检测标准操作规程》金黄色葡萄球

菌项下规定检查。

2.4.2 

供试品有抑菌作用，放大培养基量由

1

100

放大到

300

1000

，由于容器提及限制，一般放大到

500ml

1000ml

，本法适用于抑菌作

用不签的样品。

2.4.3 

采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加

在最后一次冲洗液中，取全部上清液，再以

分钟取下面液体，并将

适量的稀释剂洗涤管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，

培养，

本法适用于中等抑菌作

用的样品。

2.4.4 

在供试品溶液中加入相应的中和剂一减除供试品中抑菌成份的作用，

中和剂应对微生物无毒性，

与抑菌成份结合后的产物应对微生物无毒性，

或有毒性但不

影响待检菌的检出。

2.5 

结果判断

至少进行

次独立平行试验。

阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。

若试验组检出试验菌，

按照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌的检查；

若试验组未检出试

验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方

法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

3. 

验证的实施

3.1 

细菌、霉菌、酵母菌计数方法验证记录及控制菌检验方法验证记录（见附录）

。

3.2

分析数据，综合整个验证过程，得出验证结论。

3.3 

验证过程中发生的异常情况，按照《偏差处理程序》进行处理。

4. 

在验证

4.1 

验证时的检验条件爱你发生改变可能影响检验结果时。

5. 

附录