CLONTECH酵母双杂中文版Word文档下载推荐.doc

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单杂交对照载体信息 53

附录D：

双杂对照载体信息 54

表格列表

TableI．BDMatchmaker酵母菌株的基因型 11

TableII．BDMatchmaker酵母菌株的表型 11

TableIII．单杂交系统的载体 14

TableIV．双杂交系统的载体 15

TableV．各BD-MatchmakerDNA-BD载体的比较 19

TableVI．RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系 24

TableVII．单杂交共转化的对照实验的设置 29

TableVIII．单杂共转化对照实验：

期望的结果 29

TableIX．双杂交转化的对照实验的设置 33

TableX．双杂交配对筛选的对照实验的设置

TableXI．双杂交共转化的对照实验的设置

TableXII．双杂交共转化的对照实验：

期望的结果

TableXIII．用于PCR筛选菌落的AssemblingMasterMixs

图片列表

Figure1．使用BDMatchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用 4

Figure2．使用BDMatchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用 4

Figure3．酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤 5

Figure4．构建和筛选BDMatchmaker酵母单杂交和双杂交文库 6

Figure5．酵母菌株AH109和Y187中的报告基因 12

Figure6．BDMatchmaker酵母单杂交文库的构建和筛选 16

Figure7．BDMatchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选 17

Figure8．用BDSMART技术合成高质量的dscDNA 21

Figure9．BDCHROMASPIN纯化柱和收集管 26

Figure10．通过酵母重整合作用来构建AD融合文库 27

Figure11．为双杂交筛选AD融合文库 32

Figure12．分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略 39

Figure13．通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作用 42

Figure14．用对照用人胎盘PolyA+RNA合成双链cDNA 51

Figure15．p53HIS对照载体的图谱 53

Figure16．pGAD-Rec2-53AD对照载体的图谱 53

Figure17．pGADT7-RecTAD对照载体的图谱 54

Figure18．pGBKT7-53DNA-BD对照载体图谱 54

Figure19．pGBKT7-LamDNA-BD对照载体图谱 55

（一）介绍

BDMatchmakerTMLibraryConstruction&

Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BDMatchmakerTMSystems和BDSMARTTMcDNASynthesis的技术，只需要用任何组织的1μgpolyA+RNA或totalRNA就能构建cDNA文库。

通过一般细胞内克隆步骤，你能利用BDMatchmakerSystems所提供的灵敏的转录方法所构建的文库来进行单杂交或双杂交实验。

单杂交实验的原理——蛋白-DNA相互作用实验

单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式DNA激活序列的绑定，该序列可能是处于最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。

这个实验也可以用于预测或新蛋白的DNA绑定结构域的确定。

通过BDMatchmakerOne-HybridSystem你可以很容易的获得这些基因表达的蛋白

在BDMatchmakerOne-Hybrid实验中，潜在的DNA绑定蛋白基因是与克隆在pGADT7-Rec2（为单杂交设计的低拷贝载体）上GAL4激活结构域（AD）序列一起融合表达的。

一个或多个目的DNA序列的串联拷贝被构建在pHIS2（含有HIS3营养缺陷报告基因的报告载体）。

DNA绑定蛋白和目标序列的相互作用会激活HIS3的转录（Figure1），该过程要在宿主菌株Y187（组氨酸缺陷型）中进行并在缺少组氨酸的培养基生长

双杂交实验的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理

双杂实验分析能用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、确定疑似作用、明确结构域。

在一个BDMatchmaker双杂交实验分析中，诱饵基因是与GAL4DNA（DNA-BD）绑定结构域序列融合表达的，同时其他的基因或其cDNA与GAL4激活域（AD）序列融合表达（Fields&

Song,1989;

Chienetal.,1991）。

当诱饵与文库融合蛋白在AH109（ADE2,HIS3,lacZ,MEL1）这样的报告菌株中相互作用，DNA-BD和AD相接近结合，并激活报告基因转录（Figure2）

DNA-BD和AD的融合序列是将cDNA序列克隆进酵母表达载体pGBKT7和pGADT7-Rec载体中来实现的。

pGBKT7表达了与GAL4DNA-BD融合的蛋白，而pGADT7-Rec表达与GAL4AD相融合的蛋白。

在酵母中，两种融合基因在组成型启动子PADH1下高水平表达的。

其他的像pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge基于GAL4的克隆载体与这个试剂盒也相兼容的。

pBridge载体能被用于鉴定三蛋白复合体的酵母三杂交实验。

单杂交和双杂交实验分析的生物学基础

单杂交和双杂交方法是基于许多真核转录因子被发现是复合组成的，它们的转录激活和DNA绑第结构域在结构上和功能上是分开的。

这使研究者可以构建各种融合基因，当在酵母中表达时，能同时结合到目标DNA序列并激活下游报告基因的转录（Figure1和Figure2），BDMatchmakersystems使用的GAL4的转录激活域与DNA绑定域是被完全阐述的的转录因子（Zhu,L.&

Hannon,G.J.,2000.）

双杂和单杂文库的建立和筛选

双杂和单杂文库的建立和筛选由四个主要步骤组成，（注：

有两个步骤遵从同样的流程）。

如果想去筛选双杂交相互作用，第一步是建立一种DNA-BD融合载体。

第二步是使用试剂盒所提供BDSMART试剂从你所抽提polyA和totalRNA建立cDNA文库。

就酵母双杂筛选而言，如果你打算我们从预制的BDMatchmakercDNA文库选取来替代自己准备文库，可以跳过RNA分离、cDNA合成、AD融合文库构建。

这些包含非常广泛组织的文库被有效的保存在甘油中或预转化到Y187酵母菌株。

我们也提供一种BDMatchmaker文库服务，基于这个服务，提供给我们你想筛选的组织与细胞，我们为你制作AD融合文库。

请注意，我们尽管在高拷贝酵母表达载体中建立了很多的预制和预转化的BDMatchmakercDNA文库，对双杂工作非常理想的，但他们很少适合单杂分析。

在单杂分析中我们推荐使用pGADT7-Rec2andpHIS2等低拷贝载体，因为他们产生较少的假阳性克隆。

其次是cDNA合成，把cDNA克隆到BDMatchmakerAD克隆载体中建立一个GAL4AD融合文库，如果是建立双杂文库是pGADT7-Rec载体，单杂则是pGADT7-Rec2载体。

克隆在细胞内通过同源重组来进行的，这一步利用酵母替内高效重组系统使dscDNA和相应的GAL4AD质粒融合。

采用重组介导的克隆，文库的构建和筛选能紧密的完成，而不需要任何的细菌转化和扩增步骤。

简单的把cDNA文库和相应的BDMatchmaker载体转化到酵母中，然后把细胞用于成分缺省培养基筛选双杂作用。

Figure3.酵母单杂和双杂筛选的一般步骤，更加详细单杂和双杂筛选流程图，请参考Figures6and7.

Figure4.BDMatchmakerTM单杂和双杂文库筛选与构建.

如这个图表所示，Asthisdiagramshows,重组介导克隆使文库构建和筛选更快捷高效，尽管这里没有显示，双杂文库能通过酵母融合筛选（细节参照SectionXII）.BDSMARTTM的cDNA合成和扩增，请参照SectionIX.pGADT7-Rec被用于双杂文库构建和筛选而pGADT7-Rec2被用于单杂文库构建和筛选。

被pGADT7-Rec[2]所显示的两个相关载体有不同复制元件。

更多的信息请参照SectionX和相关的载体信息包.i

（二）试剂盒内试剂列表

此试剂盒包含有足够试剂能制备5次单杂或5次双杂文库。

去离子水、BDCHROMASPIN柱,、NaCl溶液、缺省（DO）补充物、NaOAc、LiAc、PEG、TEBuffer,、YPDPlus培养基在室温下保存；

.酵母菌株、对照PolyA+和BDSMARTIIIOligo保存在–70°

C，其他试剂储存在–20°

C.下。

cDNA第一条链合成

cDNA扩增

Trial–SizeBDAdvantageTMPCR试剂盒

cDNA纯化

单杂交文库构建

双杂交文库构建

BDYeastmaker酵母转化系统

（三）自备材料

下列试剂自备，无其他特别要求所有的试剂与溶液均储存与室温下。

cDNA第一条链合成

l无菌0.5ml离心管

lPolyA+ortotalRNA

l矿物油

l热循环仪

lDNAmarker（1-kbDNAladder）

l1.2%Agarose/EtBrgel

cDNA的分离

l1.5ml无菌离心管

l带有小架子环型支架

l95%乙醇（-20℃）

l1%氯代二甲苯

诱饵质粒构建

lE.coli感受态细胞。

像DH5αorBDFusion-Blue感受态细胞

lT4DNA连接酶

l10XT4连接buffer

lLB/amp平板

l50mMNaCl

l从E.coli转化子中提取质粒的试剂盒

酵母转化（在无菌容器中准备试剂）

lPEG/LiAc溶液

l1.1XTE/LiAc溶液

l二甲亚砜

酵母的培养与配对

lYPD培养基（参照YeastProtocolsHandbook）

lYPDA培养基（添加30mg/Ladeninehemisulfate，参照YeastProtocolsHandbook）

lTEbuffer或者无菌的蒸馏水

l适合转化的无菌试管和烧瓶

l100-和150-培养平板

l无菌玻璃棒，用于扑板弯曲的吸管

lX-α-Gal（用于酵母双杂MEL1表达的蓝白筛选）

l有agar的MinimalSDBase和没有agar的MinimalSDBase

l3-AT（抑制SD缺省his培养基背景生长）

lKanamycin储存液（50mg/ml）保存于-20℃

lAmpicillin储存液（50mg/ml）保存于-20℃

文库长期保存

l100%甘油

lYPD冷冻培养基（25%v/v甘油）

酵母双杂文库的构建与筛选

BDMatchmakerTwo-HybridLibraryConstruction&

ScreeningKit不提供下列缺省补充物。

用户必须自己从其他公司购买或者按照YeastProtocolsHandbook的附录C的配比自己准备。

lTrpDOSupplement

l–His/–Leu/–TrpDOSupplement

l–His/–TrpDOSupplement

l–Ade/–TrpDOSupplement

PCR克隆筛选

lBDMatchmakerGAL4ADLD-InsertScreeningAmplimerSet

IV．酵母菌株

酵母生长和保藏的其它信息，请参考YeastProtocolsHandbook。

我们也推荐Guthrie&

Fink的GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology（1991）和Heslot&

Gaillardin的MolecularBiologyandGeneticEngineeringofYeasts（1992）。

A基因型

TABLEI.BDMATCHMAKERTM酵母的基因型

a．GAL1,GAL2和MEL1的上游激活序列（UASs）应答于GAL4转录激活因子。

trp1,his3,gal4和gal80的突变都被删除；

leu2-3,112是一个双突变。

b.AH109衍生于PJ69-2A菌株，包括ADE2、HIS3营养标记和一个内源的MEL1基因（Jamesetal.,1996）。

lacZ报告基因被引入PJ69-2A而得到AH109菌株。

B.表现型

验证AH109和Y187表现型是很重要的（TableII）。

1.复苏冻存的菌株，用无菌环或者牙签挑少量的细胞划到YPDA平板上。

2.30°

C温育平板3到5天直到克隆出现，从这个工作平板上分离克隆增殖其他的平板。

3.按照TableII测试营养需求

a.用无菌环或者牙签，从工作平板上划3-4个克隆带单个合适的SD选择平板上。

b.30°

C温育平板3到6天。

酵母在SD选择培养基生长比YPDA培养基上要慢一些。

c.参照TableII比对你的结果，只有AH109和Y181是期望的表现型才继续进行。

4.进行菌株融合或准备感受态细胞的液体培养，要使用已分离好经过验证工作平板克隆，用保鲜膜密封好经过表型验证的工作平板，包藏在4°

C。

TABLEII.BDMATCHMAKER酵母菌株的表型

注：

l如果TRP1和LEU2功能基因被导入，AH109和Y187能够在SD/–Leu/–Trp上生长。

l如果AH109携带ADE2andHIS3基因被激活，AH109andAH109/Y187二倍体能在SD/–Ade/–His生长。

（i.e.,inthepresenceofGAL4）.

C可配对的菌株

Y187（MATα）能够与AH109,HF7c,CG-1945,Y190或SFY526（allMATa）相融合。

D.克隆的颜色和大小

lY187携带的ade2-101突变和AH109在缺乏GAL4显示Ade-表型。

在低含量的ade培养基上，克隆在几天后将变成粉红色，并在克隆老化后可能变暗。

在补充Ade的培养基上生长时，颜色变化不显著。

这些克隆生长到直径>

2mm。

由于自发缺失线粒体功能的突变，会形成1–2%小的白色克隆。

温育培养时要避免这些白色克隆。

l总体上Y187比AH109生长慢并形成明显较小的克隆。

E.报告基因

AH109包含四个在三个远距离GAL4上游调空序列（UASs）和TATAboxes调控下的ADE2,HIS3,MEL1和lacZ四个报告基因（Figure5）。

ADE2报告基因针对ADE2andHIS3，单独提供强的高严紧度的营养选择，减少假阳性率（Jamesetal.,1996）。

你也可以选择分析编码α-galactosidase的MEL1。

由于α-galactosidase是一种内分泌酶，MEL1对于Y187和AH109两者是内源性的，可以通过添加X-α-Ga到选择平板来检测他的的活性，如果X-α-Gal存在，MEL1被激活，克隆将变成兰色。

由于在完整的GAL1UAS调控下，在阳性的双杂分析中Y187的lacZ表现出高水平的诱导β-galactosidase活性。

Figure5.酵母菌株AH109和Y187中的报告基因。

AH109是由PJ69-2A派生而来，包括了ADE2和HIS3两个营养合成基因（Jamesetal.,1996）。

MEL1是GAL4的内源效应基因。

lacZ报告基因被引入PJ69-2A而建成AH109。

HIS3，ADE2和MEL1/lacZ报告基因都在不完全的GAL4效应序列和启动子元件GAL1，GAL2，MEL1的分别控制下

F.缺失HIS3的表达

l3-AT是酵母HIS3蛋白的竞争性抑制剂。

它被用于在缺省方式下阻止低水平的His3p的表达，抑制缺省hisSD培养基的北京生长。

l由于诱饵蛋白内在的dna结合特性，源于AH109的转化子可能表现出稍高HIS3表达。

通常少量3-AT足以抑制SD/–His上的背景生长。

然而，如果你的选择是针对his3和ade2两者共同表达的，在初始文库筛选中没有必要去抑制缺省的HIS3。

l某些酵母菌株有相对较高本底水平的His3p，如果你使用Y190作为宿主菌，在培养基中需要25–45mM3-AT去抑制背景生长。

l在你的选择培养基中优化3-AT的浓度

在你开始这个步骤以前，注意这个试剂盒不提供–His/–Trp缺省补充物，你必须自己单独购买或者按照YeastProtocolsHandbook的目录c的配比自己准备。

1.铺酵母转化子于一系列的不同3-AT浓度的SD/–His/–Trp平板上。

l如果你采用是包含有像pGBKT7这样DNA-BD质粒的AH109转化子，我们推荐你从0到15mM之间开始测试3-AT的浓度（0,2.5,5,7.5,10,12.5,15mM）

l如果你是采用包含有pHIS2报告质粒Y187转化子，我推荐你从10到60mM之间测试3-AT的浓度。

这些仅仅是推荐，优化浓度的高低主要依赖于使用的构件和菌株。

2.使用低浓度的3-AT，一周后，仅允许小的克隆去生长。

培养基中太多的3-AT能

新的转化细胞。

（五）.酵母载体

A．单杂交系统

1、克隆载体

l信号载体pHIS2：

cis-actingDNA片段插在HIS3营养报告基因的上游多克隆位点（MCS）上，与HIS3基因（PminHIS3）启动子区相链接。

在信号载体上还有一段高度保守的低拷贝的CEN6/ARS4序列。

l克隆载体pGADT7-Rec2:

表达一个与GAL4激活结构域（AD）相融合的蛋白，用于酵母中同源重组介导的克隆（图4）。

因此用户可以用Sma1消化的pGADT7-Rec2（提供的）和dscDNA（BDSMART文库构建法得到的）（SectionIX）通过酵母转化构建cDNA/AD融合文库。

2、对照载体（附录C）

l阳性对照载体p53HIS2：

由DNA片段（包含至少3个连续拷贝的p53cis-actingDNA序列）插在pHIS2载体的多克隆位点上构成。

插入片段在载体中HIS3基因（PminHIS3）及其启动子的上游。

l阳性对照载体pGAD-Rec2-53：

编码一个融合于GAL4AD的鼠源p53蛋白。

包含p53HIS2和pGAD-Rec2-53的酵母细胞可以在缺组氨酸的SD培养基（如SD/–His/–Leu/–Trp）上生长。

a、HA是血凝素，这些免疫标记用于通过体外的免疫共沉淀来鉴定蛋白与蛋白相互作用，使用的抗体和实验方案由BDMatchmakerCo-IP试剂盒提供。

它们不适用于检测、亲合纯化和酵母内表达蛋白的免疫共沉淀。

b、通过SV40LargeTPCRFragment和pGADT7-Rec共转化，在体内同源重组产生的。

c、DNA-BD和AD载体有不同的营养标记，酵母转化子被涂布在缺少特定成分的基础培养基他们可以被单独地筛选出来。

B．双杂交系统

2.克隆载体

lpGBKT7：

被用于表达一种与GAL4DNA结合结构（DNA-BD域融合的蛋白。

lpGADT7-Rec：

被用于表达一种与GAL4激活结构域（AD）融合的蛋白。

这个载体被设计成针对同源重组介导的克隆。

提供的pGADT7-Rec是被SmaI消化的线形DNA。

3.对照载体

a.阳性对照

lpGBKT7-53编码一种GAL4DNA-BD和鼠源的p53融合蛋白。

lSV40LargeTPCRFragment编码SV40largeT-antigen。

一起使用这个DNA片段和pGADT7-Rec去检测酵母转化重组的效率。

SV40LargeTPCRFragment和pGADT7-Rec重组形成pGADT7-RecT，它编码GAL4AD和largeT-antigen的融合蛋白。

lp53和SV40largeT-antigen在酵母双杂分析中相互作用

b.阴性对照

lpGBKT7-Lam编码一种GAL4DNA-BD和人类laminC融合基因，提供一个对照，针对一种不相关的蛋白和pGADT7-RecT和你的AD/library的质粒两者之一的意外作用。

LaminC既不形成复合体也不于大多数蛋白相互作用。

TABLEIV.双杂系统的载体

a.HA是血凝素，这些免疫标记被用于通过体外的免疫共沉淀来鉴定蛋白与蛋白相互作用，使用的抗体和实验方案由BDMatchmakerCo-IPKit提供。

它们无意被用于去检测、亲合纯化或者酵母内表达的蛋白的免疫共沉淀。

b.通过SV40LargeTPCRFragment和pGADT7-Rec共转化，在体内同源重组产生的。

c.DNA-BD和AD载体有不同的营养标记，当酵母转化子被扑到缺少特定成分的基础培养基他们可以被单独的选择。

d.载体可以携带不同的抗生素标记因此可以在E.coli.中单独选择。

（六）酵母双杂交文库构建与筛选

（七）酵母双杂交文库的构建和筛选VII、构建酵母单杂