酵母双杂交操作步骤中文翻译.docx

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酵母双杂交操作步骤中文翻译

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酵母双杂交操作步骤（中文翻译）

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：

1.次序转化:

指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/baitplamid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（ADfuionlibrary）转化进去。

优点：

就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2.共同转化：

将两种质粒一起转化进酵母中。

优点：

比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：

kanamycin（卡那霉素）？

pGADT7----的选择物是：

ampicillin（氨苄西林）？

各种SD培养基：

1）SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-hi（组氨酸）（1000ml）（？

“四缺”）

酵母氮源（YNB）：

6.7g;

-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.60g（购买来就配好的）;葡萄糖20g（即2%）

2）SD/-leu/-trp/-hi（1000ml）

酵母氮源（YNB）：

6.7g;

-leu/-trp/-hiDOupplement0.62g;（购买来就配好的）葡萄糖20g.（即2%）

3）SD/-leu/-trp（1000ml）（？

“二缺”）

酵母氮源（YNB）：

6.7g;

-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.64g（购买来就配好的）;葡萄糖20g（即2%）

4）SD/-leu（1000ml）

酵母氮源（YNB）：

6.7g;

-leuDOupplement0.69g;（购买来就配好的）葡萄糖20g（即2%）

5）SD/-trp（1000ml）

酵母氮源（YNB）：

6.7g;

-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.74g;（购买来就配好的）

葡萄糖20g（即2%）

注意：

YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。

我们这用的是含硫酸铵的。

（买来就加进去了的）。

如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。

实际配制的方法是：

1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃

以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。

（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DOupplement在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大约加10MNaOH200ul即可），之后补水至950ml。

3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50ml40%葡萄糖。

YPD培养基（1000ml）

20g/L蛋白胨10g/L酵母提取物

20g/L琼脂（只有制作平板才用）20g/L葡萄糖（即2%）

1某YPDA培养基（1000ml）

20g/L蛋白胨

10g/L酵母提取物

0.03g/L腺嘌呤（即终浓度为0.003％）腺嘌呤可以耐受高温20g/L葡萄糖（即2%）

实际配制的方法是：

1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃

以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。

（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml腺嘌呤溶液加入。

（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压）3.（蛋白胨20g；酵母提取物10g；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，121℃高压15min。

注意：

高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可。

可以在YPDA中加入20g/L的琼脂，以配成平板。

需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15mg/L。

（kanamycin可以20℃贮存一个月，

加入到平板中去可以4℃贮存一个月。

）

PEG/LiAc溶液（即配即用）

用下列贮存液来配制

50%PEG3350：

用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。

10某TEbuffer：

用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。

10某LiAc：

用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。

最后配成PEG/LiAc溶液是：

（以10ml为例）

终浓度为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质PEG400040%8mlof50%PEGTEbuffer1某1mlof10某TELiAc1某1mlof10某LiAc

无菌1某TE/LiAc溶液（用10某已灭菌的贮存液稀释）

10某TEbuffer:

0.1MTri-HCl,10mMEDTA,pH7.5（高压）10某LiAc：

1M用稀醋酸调节PH至7.5高压

Forβ-galactoidae滤膜实验Zbuffer溶液：

Na2HPO47H2O16.1g/L（如换Na2HPO414H2O则20.739g/L）NaH2PO4H2O5.50g/L（如换NaH2PO42H2O则6.21g/L）KCl0.75g/LMgSO47H2O0.246g/L

最后调PH至7.0，高压，室温下可以贮存1年

某-gal溶液：

某-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20mg/ml.，–20°C避光保存

Zbuffer/某-gal溶液：

100mlZbuffer

0.27mlβ-mercaptoethanol（β-巯基乙醇）1.67ml某-gal贮存液

ONPG溶液：

（即配即用）

ONPG溶于Zbuffer中，终浓度4mg/ml，调PH至7.0.注意：

1.ONPG需要1～2h才能溶解2.每次用之前新鲜制备。

带有β-巯基乙醇的Zbuffer

将0.27mlβ-巯基乙醇加入100mlZbuffer中即可

为了转化成功的小提示：

1.用一个1～3周龄（直径2～3mm）的菌落去接种液体培养基。

如果菌落直径＜2mm，就用多几个菌落去接种。

（也要大力涡旋使细胞团分散开来。

）2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。

3.当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞。

4.为了提高转化效率，要在1小时内准备酵母感受态细胞。

如果有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低。

5.当进行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量必须过度，而AD质粒的量要不足。

一般BD是AD的两倍。

（李博士：

此要求一般是针对文库筛选而言）

6.为了使菌落更好地生长，在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收。

可以选择直径5mm的无菌玻璃珠（每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠，直径150mm的平板用7-9个玻璃珠）去促进转化复合物的扩散，摇动的时候haketheplatebackandforth—notroundandround.（科内似并无此操作，而仅仅以玻棒涂布耳）

一.复苏酵母：

将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养，培养1-3周。

（接种的时

候采取四区分区画线法）

二.酵母感受态细胞置备和转化步骤：

1.取直径2～3mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中。

2.剧烈振荡或涡旋5min，使所有团块分散开来。

3.转移酵母液到50mlYPD（？

固体——也有液态的，未加入琼脂粉耳）或者SD培养基中。

4.置于30℃摇床中，以250rpm的转速震荡培养基16～18h，直到OD600>1.5

5.转移部分过夜培养物（30ml）到300mlYPD培养基（？

固体）中，使最终OD600在0.2～0.3之间。

6.30℃摇床以230rpm的转速震荡培养基3～4h直至OD为0.4～0.6.（IftheOD600i<0.4,omethingiwrongwiththeculture）7.转移酵母液至50ml离心管中，1000g室温（20～21°C）离心5min8.弃去上清，加入25～50ml无菌水或无菌的1某TE重悬酵母。

9.在1000g室温（20～21°C）条件下离心5min10.轻轻倒出（弃去）上清

11.将细胞重悬于1.5ml新鲜准备的，无菌的1某TE/1某LiAc（在实验开始之前置备）

（至此酵母感受态细胞制备完毕）

12.向无菌的1.5ml微量离心管中加入质粒DNA各0.1ug和0.1mg鲱鱼精载体DNA，之后轻轻混匀。

我做的实验应该如下：

实验组1.2.阳性对照阴性对照pGBKT7-lampGADT7-T用量0.2ug0.1ugpGBKT7-HBcAgpGBKT7-53pGADT7-3F/3GpGADT7-T之后轻轻混匀13.再向每管中加入0.1ml酵母感受态细胞，并且震荡混匀。

14.向每一管加入600ul无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀。

15.30℃摇床以200rpm的转速振荡培养30min

16.向每一管加入70ulDMSO轻轻颠倒混匀，不要震荡。

17.42℃水浴热激15min

18.取出后在冰上冷却1-2min

19.1000rpm室温离心5min，弃去上清。

20.用0.5ml无菌的1某TE重悬酵母。

21.取合适体积的菌液（一般是100ul）涂在选择性的SD培养基的平板上，在30℃培养箱

中培养2-4天。

（将克隆分成三份涂与不同平板上，1/3涂在SD/–Hi/–Leu/–Trp，1/3涂在SD/–Ade/–Hi/–Leu/–Trp，最后1/3涂在SD/–Leu/–Trp上。

）（科内仅涂布二缺与四缺板）（在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板）因为在二缺板中AH109能生长，说明BD和AD已经转进去了。

如果在四缺板中能生长，说明诱饵和文库肯定有作用，接着做一个α-gal实验。

如果是将质粒转到Y187中的话，21步之后涂一个二缺板就行了。

如果酵母能生长的话就接着做一个β-gal。

所以有的人同时转化两种菌种。

这样就完全可以确定两蛋白是否有作用了。

之后计算转化率，如果转化率达到10的6次方以上，那么就可以接着做后面的检验实验。

三.α和β-gal实验：

（我就做β

1.试剂：

-gal试验，要注意如果做β-gal的话，这

时候菌种要换成Y187，而不是之前的AH109）（在protocol的24～28页）

2.原理：

ONPG为无色物质，在β-半乳糖苷酶的作用催化下生成黄色的onitrophenol（硝基苯

酚），在420nm（OD410）处有光吸收。

Na2CO3可以提高PH值，使酶变性，从而终止反应。

（Na2CO3在配制时，不需要高压）

3.实验方法

一.Colony-liftFilterAay（滤膜分析或滤膜试验）（这是定性试验）

a）将要测试的菌株（直径1-3mm）转接到新的选择性SD培养基中，30℃培养2-4天。

b）准备Zbuffer/某-gal溶液。

c）为每一个要测试的平板准备好一张无菌的Whatman滤纸，置于100mm或150mm无菌平板中用2.5-5mlZbuffer/某-gal溶液浸泡。

d）用无菌的镊子小心地将无菌Whatman滤纸覆盖到平板表面，要使所有的待测菌株都有

部分沾到滤纸上。

e）用注射器在滤纸上打3个或更多的不对称的孔，以标志方向。

f）滤纸放入液氮中0.5～1min至结冰，之后再放置于室温融化，如此反复冻融3次。

g）小心地将带有菌株的滤纸放到预浸泡的滤纸上，有菌株一面向上，注意两层滤纸中间不

要有气泡。

h）平板放到30℃培养箱中，观察其是否变蓝。

一般阳性克隆在0.5～8h内会变蓝，超过

8h容易产生假阳性结果。

二.LiquidCultureAay（以ONPG为底物的液体培养法）（这是定量试验）1）在合适的SD培养基中制备5ml过度培养物。

注意：

你所选用的SD培养基要适合你所用的系统和质粒。

2）在进行实验当天，将ONPG以4mg/ml的浓度溶于Zbuffer中，振荡1～2h确保完全

溶解。

3）大力涡旋过夜培养基1min以分散细胞团块，立即转移2ml（0.5ml）过夜培养基物到8ml

（2ml）YPD培溶液中。

（以25%的含量加）4）30℃培养3～5h（230-250rpm）直至细胞进入对数生长期（1ml溶液的OD600应在0.5-0.8

之间）在收获细胞的同时记录OD600值。

注意：

在检测OD值的时候，涡旋培养基0.5-1ml以分散细胞团块5）各吸取1.5ml（0.5ml）培养物到各3个1.5ml离心管（每个管子就是1.5ml），离心14000

rpm/30ec。

6）小心移去上清，加上1.5ml（0.5ml）Zbuffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。

7）再次离心并移去上清，加上300ul（100ul）Zbuffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。

这样，终浓度就是1.5/0.3=5倍。

注意：

在这个清洗步骤之后，细胞收获物的差异可以通过再次读取OD600值来纠正。

8）转移0.1ml细胞悬液至新的离心管中。

9）将细胞置于液氮中（约0.5～1min）直至细胞冰冻。

10）将离心管放于37℃水浴中0.5～1min使其融化。

11）反复冻融3次（重复9和10步）确保细胞裂解。

12）用100ulZbuffer.来设置一个空白对照。

13）加0.7ml的Zbuffer与β-巯基乙醇到反应管和空白管中

注意：

在冰冻之前不要加Zbuffer

14）立即加160ulONPG（溶于Zbuffer中）至各反应管和空白管中，开始计时。

15）将各管放入30℃水浴中。

16）待出现黄色后，加0.4ml的1MNa2CO3至各反应管和空白管中，以分钟计算消退时间。

注意：

需要的时间可能会变化，（对于单个的β-gal阳性对照质粒约需3～15min，对于双杂交阳性对照约30min，弱的反应可能需24h.）

黄色不稳定，并且随时间延长可能加剧。

每一批需要做一个新的空白管。

17）14,000rpm离心10min，以除去细胞碎片。

18）仔细小心转移上清到清洁比色杯中。

注意：

如果上清中若混有细胞碎片，将严重干扰本实验的精确性

19）以空白管在A420校准分光光度计，并且测量在OD420值。

OD420值终在0.02-1.0之间才

会处于线性范围内。

20）计算β-半乳糖苷酶单位，1个单位的β-半乳糖苷酶被定义为每个细胞每分钟水解

1umolONPG为邻硝基苯酚和D-半乳糖所需要的量。

β-半乳糖苷酶活性单位=1000某OD420（t某V某OD600）t=孵育过程中黄色消退的时间（min）V=0.1ml某浓度因子

OD600值=1ml培养基的OD600值注意：

这里的终浓度因子是5（第七步），然而可以试用几个不同的稀释度以确保分析位于线性范围内。

为了减少实验的变异性，需挑5个单独的克隆，每个克隆进行3次试验。