琼脂糖电泳.docx

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琼脂糖电泳

琼脂糖电泳

琼脂糖电泳技术

一、琼脂糖凝胶电泳可以：

（1）用于DNA切胶回收；

（2）用于DNA分离；（3）用于佐证DNA是否重组、质粒等是否切开以及其他分子生物学研究。

二、DNA分子量标准的制备

采用EcoRI或Hind皿酶解所得的入DNA片段来作为电泳时的分子量标准。

入DNA为长度约50kb的双链DNA分子，其商品溶液浓度为0.5mg/ml，酶解反应操作如上述。

HindHI切割DNA后得到8个片段，长度分别为23.1,9.4,6.6,4.4,2.3,2.0,0.56和0.12kb。

EcoRI切割lDNA后得到6个片段，长度分别为21.2,7.4，5.8，5.6，4.9和2.5kb。

三、琼脂糖凝胶的制备

1、取5XTBE缓冲液20ml加水至200ml，配制成0.5XTBE稀释缓冲液，待用。

2、胶液的制备：

称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml0.5XTBE稀释缓冲液，放入微波炉里（或电炉上）加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。

加热过程

中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。

加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。

3、胶板的制备：

将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏（宽约1cm）紧密封住。

将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。

向冷却至50-60C的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（EB）溶液使其终浓度为0.5卩g/m也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用0.5卩g/ml的EB溶液浸泡染色）。

用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。

倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。

待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5XTBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。

因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

4、加样：

取10卩酶解液与2卩l6载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。

若DNA含量

偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。

每加完一个样品要更换tip

头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

5、电泳：

加完样后，合上电泳槽盖，立即接通

电源。

控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。

当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm

时，停止电泳。

6、染色：

未加EB的胶板在电泳完毕后移入

0.5卩g/m的EB溶液中，室温下染色20-25分钟。

7、观察和拍照：

在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。

DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。

紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。

经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6，曝光时间10-120秒（根据荧光条带的深浅选择）。

&DNA分子量标准曲线的制作：

在放大的电泳照片上，以样品槽为起点，用卡尺测量入DNA的EcoRI和Hind皿酶切片段的迁移距离，以厘米为单位。

以核苷酸数的常用对数为纵坐标，以迁移距离为横坐标，在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线，即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。

9、DNA酶切片段大小的测定：

在放大的电泳照片上，用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离，根据此数值，在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值，进一步计算出各片段的分子量大小

（若用单对数坐标纸来绘制标准曲线，则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小）。

反之，若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。

10、DNA酶切片段排列顺序的确定：

根据单酶切，双酶切和多酶切的电泳分析结果，对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理，然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。

以环状图或直线图表示，即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。

［注意］

1、酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。

2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：

在最适反应条件下，1小时完全降解1mg1DNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象1DNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。

反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。

3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1X）进行稀释。

另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，

应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则,酶活性将受影响。

4、观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有切割作用。

从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯（300-360nm），以减少紫外光切割DNA。

5、EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用

时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面

上。

凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

6、当EB太多，胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30分钟后再观察。

四、原理：

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：

它兼有分子筛”和电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

五、一、试剂配制

1.5XBE缓冲液：

450mmol/LTris-硼酸，10mmol/LEDTA，pH值8.0。

使用时将上述储存液稀释10倍至0.5>TBE缓冲液，可同时作为电

泳及制胶用的缓冲液。

二、制胶

1.根椐制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉（总液体量不宜超过锥瓶的50%

容量）。

琼脂糖粉末与0.5XTBEbuffer的比例（w:

v）参考表1，常用琼脂糖浓度为0.7-1%表1琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围

琼脂糖

浓度

最佳线

形DNA

分辨范围（bp）

0.50%

1

000〜

30000

0.7%

800〜

12000

2.在锥瓶的瓶口上盖上保鲜膜或牛皮纸，并在膜或纸上扎些小孔，然后在微波炉中加热溶解琼脂糖。

加热时，当溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。

此操作重复数次，直至琼脂糖完全溶解。

3.使溶液冷却至50C-60C左右，如需要可在此时加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5卩g/ml）或按照1aL/30mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混匀。

4.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。

凝胶厚度一般在3~5mm之间。

制胶模如下图所示，小胶倒入25-30mL左右琼脂糖溶液，大胶则60-70mL左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。

5.在室温下使胶凝固，大约30分钟〜1小时。

1.5XBE缓冲液放置时间过久会沉淀，因此一次性不要配太多。

工作用电泳缓冲液为0.5>TBE缓冲液，取5>TBE缓冲液贮存液稀释，现配现用。

2.用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。

3.琼脂糖粉在微波炉中加热时间不宜过长，每

次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。

溶解琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。

4.凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4C下保存，一般可保存2〜5天。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。

电泳缓冲液的pH在6〜9之间，离子强度0.02〜0.05为最适。

常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。

普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

三、上样

1.取适量样品与6肚样缓冲液混匀（如：

1卩样品与5卩6＞上样缓冲液），用微量移液枪小心加入样品槽中。

2.上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40卩I为上限，大孔200卩I为上限，具体和制胶膜规格相关）。

3.每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

四、电泳

1.加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。

控制电压保持在110V，电流在40mA以上。

2.当条带移动到距凝胶前沿约2cm时（约40min），停止电泳。

3.紫外下拍照并观察