脂肪酶活检测原理及方法.docx
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脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：
一、原理以及标准曲线做法
1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenylester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种
底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。
2.所需试剂有：
CAS碳链长度出货号价格名称
830-03-5 C2 N8130-1G￥462 对硝基苯乙酸酯
2635-54-9C4 N9876-1G ￥570对硝基苯丁酸酯
1956-10-1 C8 21742-1G-F￥487对硝基苯辛酸酯
1956-11-2C12 61716-1G￥435对硝基苯月桂酸酯
1492-30-4 C16N2752-1G￥379对硝基苯棕榈酸酯
14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97对硝基苯硬酸脂
全部为色谱纯试剂，购于sigma公司
3.标准曲线绘制：
a.标准对硝基苯酚母液（2mM，2mmol/L）:
称取0.02789g的对硝基苯酚（p-NP）溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：
b.标准曲线绘制：
分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液（2mM），用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：
mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：
全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：
分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r/min，3min，测出标准曲线。
↗
体系液180（μL）+酶液（40μL）
↘
B液（pH缓冲液）：
162μL
此步骤中，底物再次被稀释，浓度为0.889mM。
方法二：
（吸光度法，精准，速度慢）
a.溶液的配制
溶液A:
30.0mg对硝基苯棕桐酸脂（p-NPP，Sigma，或者其他底物）溶于10.00ml异丙醇，4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶8-10次测定，或用于8-10个酶一次测定，或用于一个酶4次密精测定；
溶液B:
缓冲液（pH缓冲液，可更改）100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4℃保存。
b.脂肪酶的活力测定（以单个酶液做一个/两个对照为例）
①准备试管30个，10个15ml离心管；
②取1ml/1.2ml溶液A加入到9ml/10.8ml溶液B于离心管中，充分混匀，37℃水浴保温5min，分装至3/4个试管中，每个2.7ml，即体系液；
③向每个试管中加入适量酶液（粗酶液加300μL），对照组中加入灭活酶液（沸水煮沸5min），加入酶液后即为反应液；
④37℃反应10-15min，加入95%乙醇终止反应，在410nm下测定吸光值，每个样品重复2/3次，取平均值。
三、96孔板装样方式：
步骤一：
温度不变，定为40℃，以pH和底物为变量，先在EP管内反应，后加入至96孔板中。
其中每个孔是220μL体系。
pH缓冲液分别采取PBS缓冲液（7、8）、Tris-HCl缓冲液（8、9）。
a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：
40*80=3.2ml，其中需要灭活的是800μL。
以方便计算以及加样，取4ml酶液，1ml用来灭活。
b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：
18*16=288μL，以方便计算和加样，取300μL。
c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例，需要每个酶液4ml，每个底物900μL。
表为96孔加样模式：
C2等代表底物，后面的数字代表pH，红色字体表示一个空白对照和三个平行。
蓝色字体中，pH8分别用了PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液，以便比较不同缓冲液对酶活的影响。
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A
C27空白
C27
平行
C47空白
C47
C87空白
C87
C127空
C127
C167空
C167
B
C27
平行
C27
平行
C47
C47
C87
C87
C127
C127
C167
C167
C
C28空白
C28
C4空白
C48
C8空白
C88
C12空白
C128
C16空白
C168
D
C28
C28
C48
C48
C88
C88
C128
C128
C168
C168
E
C28Tri空白
C28Tri
C48Tri空白
C48Tri
C88Tri空白
C88Tri
C128Tri空白
C128Tri
C168Tri空白
C168Tri
F
C28Tri
C28Tri
C48Tri
C48Tri
C88Tri
C88Tri
C128Tri
C128Tri
C168Tri
C168Tri
G
C29Tri空白
C29Tri
C49Tri空白
C49Tri
C89Tri空白
C89Tri
C129Tri空白
C129Tri
C169Tri空白
C169Tri
H
C29Tri
C29Tri
C49Tri
C49Tri
C89Tri
C89Tri
C129Tri
C129Tri
C169Tri
C169Tri
步骤二：
pH不变，以温度和底物为变量，先在EP管内反应，后加至96孔板中。
其中每个孔是220μL体系。
a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：
40*60=2.4ml，其中需要灭活的是600μL。
以方便计算以及加样，取3ml酶液，750ml用来灭活。
b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：
18*12=216μL，以方便计算和加样，取250μL。
c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例，需要每个酶液3ml，每个底物750μL。
表为96孔加样模式其中C2等代表底物，后面的数字代表温度，红色字体表示一个空白对照和三个平行。
40℃因已经在上个步骤中做过，不再重复。
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A
C230空白
C230平行
C430空白
C430
C830空白
C830
C1230空白
C1230
C1630空白
C1630
B
C230平行
C230平行
C430
C430
C830
C830
C1230
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C1630
C1630
C
C250空白
C250
C450空白
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C850空白
C850
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C1250
C1650空白
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D
C250
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C450
C450
C850
C850
C1250
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C260空白
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C860空白
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C1260
C1660空白
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C460
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C860
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C1260
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