westernblot失败经验总结.docx

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westernblot失败经验总结

western blot失败经历总结1

我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！

蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~假设单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存〞的原那么比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loadingbuffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余参加loadingbuffer100度充分变性，再分装保存。

有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。

另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng〔虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg〕，最好在10ng以上为好。

这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否那么就不好办了。

最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。

western blot失败经历总结2

我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会

1、跑胶电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否那么就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑别离胶，不要追求速度，渐渐跑条带会别离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；

2、转膜我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提早一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。

ＷＥＳＴＥＲＮ ＢＬＯＴＴＩＮＧ心得

１．  总蛋白提取〔胞膜，胞浆，胞核〕：

组织匀浆后,15000g,4度,20分钟后,取上清.

Buffer:

NP40750ul,脱氧胆酸钠,SDS,加1*PBS至100ml.再参加PMSF（7.4mg/ml）0.1ml.（现用现加）

7.4mg/mlPMSP异丙醇溶液:

取AmgPMSF加A/7.4ml异丙醇.工厂-20度储存

２．组织膜蛋白提取：

所在操作冰上进展

〔1〕取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液.参加10mlBufferA,用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。

每次30秒,重复3-5次.

〔2〕离心机1000rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。

（去掉大块组织及结缔组织）

〔3〕100000g，4℃离心1hr,弃去上清.（此为胞浆蛋白,假设只提取胞浆蛋白,可用10000rpm,4度,30分钟离心，取上清即可）。

沉淀用适量的BufferB重悬，4度过夜后，分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

〔4〕搜集所得上清液即为膜组份。

BufferA：

蔗糖，5mMTris-HCl〔PH7.5〕，120mMKCl，1mMEDTA,1mMEGTA,PMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。

冰上预冷。

BufferB20mMHEPES〔PH7.5〕，10%甘油，2%TritonX-100,1mMEDTA,1mMEGTA,，PMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。

冰上预冷。

所得蛋白分装EP管〔每管约50ul〕，取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。

假设要定量的话，最好能立即根据浓度，参加上样缓冲，煮沸，4度保存。

反复冻融蛋白会降解，浓度不准。

考马斯亮兰Ｇ２５０测蛋白浓度：

考马斯亮兰Ｇ２５０配方：

G250,95%乙醇100ml,85%磷酸200ml,加水至2000ml,过滤后使用。

BSA标准液：

0.5mg/mlBSA,双蒸水配制。

配制标准液（浓度分别为0，10，20，30，40，50ug/ul）：

  1  2  3  4  53  6

G250  3ml  3ml  3ml  3ml  3ml  3ml

0.5mg/ml

BSA  ------  20ul  40ul  60ul  80ul  100ul

ddH2O  100ul  80ul  60ul  40ul  20ul  -----

待测蛋白配液：

每管3mlG250，2ul样品，98ulddH2O。

〔假设参加样品后，液体没有变蓝色，那么可再加2ul样品，ddH2O减为96ul，标准液浓度可适当扩大。

〕

紫外分光光度计，595nm，用1号管调零，制出标准曲线,标准方程及R值〔R值应大于0.99,否那么操作误差较大〕,测量待测蛋白OD值，算出蛋白浓度。

〔假设参加2ul样品，那么浓度值需除2，方为真正浓度；假设加4ul样品，那么除4〕

聚丙烯酰胺电泳：

1．自来水，洗涤剂清洗玻璃板，用ddH2O冲洗干净，立放于盒子内，60度烤箱烘干备用。

2．配胶：

凝胶储藏液〔30%Acr/Bise〕：

丙烯酰胺29克，双体甲叉双丙烯酰胺1克，加水至100ml。

〔有说要棕色瓶保存，3个月换新的，30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉〕

10%APS：

过硫酸铵，加ddH2O至1ml.（4度保存,一周内使用），本人都是配新颖的用。

10%SDS:

1克SDS,10mlddH2O.（不溶时,可加热50度左右助溶.）

TEMED:

原液即可.

Tris-HCl（PH6.8）；

Tris-HCl（PH8.8）:

Tris,参加ddH2O溶解后,用HCL调PH至8.8,加ddH2O到50ML

配胶的浓度和方法书上都有，不详细说了！

本人做的是70KD和17KD的分子量，分别配了10%和12%的别离胶，4%的浓缩胶。

摇动溶液充分混合〔不要过于剧烈以免引入过多地氧气〕灌入2/3的别离胶后〔估计距梳子底1CM〕应立即用ddH2O封胶。

等到能看清水和胶的分界限，那么可配浓缩胶。

用面巾纸吸干水后，注入浓缩胶，至顶。

插入梳子，不要有气泡。

蓝色字体是从别人贴子上看到的

这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺〞比率的增加而变小，比率接近1：

20时孔径到达最小值。

SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺〞为1：

29配制，试验说明它能别离大小相差只有3%的蛋白质。

别离胶及浓缩胶均可事先配好〔除AP及TEMED外〕，过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡〔否那么凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟〕，参加10%AP〔0.7~0.8:

100,别离胶浓度越高AP浓度越低，15%的别离胶可用到0.5:

100〕及TEMED〔别离胶用0.4:

1000,15%的可用到0.3:

1000，浓缩胶用0.8：

1000〕

PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在?

分子克隆?

上有详细的阐述。

容易无视的问题主要在于过硫酸铵〔AP〕一定要新颖——最好用小指管配AP〔写日期〕保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复翻开使用屡次的AP都别用。

胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS〕，封胶后切记，勿动。

如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力去除残留水滴。

等浓缩胶凝的时间，就可以配蛋白了。

按照想要的浓度参加LOADINGBUFFER配制。

本人按每孔总体积20ul,终浓度1*RSB，含50ug蛋白混合样品，缺乏的体积用1*PBS补足。

短暂离心后，沸水中煮5分钟，放室温，用时再短暂离心。

例如.50ug/20ul，做2.5孔,即50ul，125ug

  1  　　　　　　　2  　　　　　　　　3  　　　　　4

蛋白浓度  10．33ug/ul  13．91ug/ul  14．87ug/ul  19．03ug/ul

所需体积  12.1ul  　　　　　　9ul  　　　　　　8.4ul  　　　　　6.6ul

5*RSB  10ul  　　　　　　10ul  　　　　　　10ul  　　　　　10ul

1*PBS  27.9ul  　　　　　　31ul  　　　　　　31.6ul　　　　33.4ul

5*RSB:

Tris-HCL（PH6.8）,5克SDS,溴酚蓝,25ML甘油.（很粘稠）

Beta-巯基乙醇用时现加,按25%比例.

10*PBS:

Nacl,Na2HPO4.12H2O,NaH2PO42H2O,调PH到7.2-7.4,加ddH2O到500ML

约30分钟左右,取下梳子,将胶板放入电泳槽内,参加1*电泳缓冲液,冲洗加样孔.微量进样器逐个加样,空泳道参加1*RSB.两胶板之间的电泳液要满.接好正负极,开始电泳,可先小电压,约50V,大约跑过浓缩胶后再改为100V.观察MARKER的情况,适时终止电泳.

建议说目的带要跑到别离胶的2/3处比较好,但本人一直都在上1/3处,结果也还可以.

预染MARKER很重要,开始选了一个国产的,总是跑不好,后来换成NEB的,效果很好,而且也不贵,范围也比较广,把我要的7.,42.17全都包括在内.

假设浓缩胶跑的好的话,几个孔的蛋白会跑成一条直线.

注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为防止边缘效应，可在未加样的孔中参加等量的样品缓冲液

未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子略微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要防止枕头刺入胶内.

10*电泳缓冲液:

Tris,甘氨酸36克,SDS,ddH2O定容到250ML.

不好溶,可用搅拌器.

可重复使用,每次加一些新的进去.但本人每次都是配新的,也不费事.

转膜

跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟,脱色液脱色,看看蛋白条带跑的如何,上样量如何.

另一块可用做转膜.放入转移缓冲液中摇30分钟左右〔有次着急只晃了10分钟，结果也挺好的〕。

开始用的PVDF膜,0.45um,用国产的MARKER后,总是染的不清楚,而且无论时间长短,最后一块滤纸都会被染色.后来换了NEB后,PVDF也不容易上色（可能和PVDF的质量有关,我买的虽然也是MILLIPORE,但好似比较廉价20CM*10CM才50块钱）.丽春红染色也很少能看清条带,后来发现,染色后用甲醇洗,比较容易看出来,但是很难洗掉红色，不知道有没有影响。

后来换成NC膜，0.22um，效果挺好的，MARKER易染上，丽春红也易着色，还一洗就掉。

能比较清楚的理解转膜效果。

不同转膜仪和电源转膜的条件不同，我用的是BIO-RAD的半干转〔电压不过25V的那款〕，电源是BIO-RAD的PC200，70KD的我转50分钟，20V，17KD的转20V，30分钟左右，条件不是很稳定，有时半路翻开盖子看看MARKER转的情况，但膜和胶的位置一定不能窜。

也有人说用恒流，说1.2-2MA/CM2我看了一下，我的胶大约都是5*3左右大的，20V一般电流会是60-30MA之间，要是这样算的话,最高就30MA,我不太清楚.

假设用PVDF膜，先用甲醇浸泡一段时间，我一般是5分钟，但也有人说不过30秒，不清楚。

换了NC膜就直接放入转移缓冲液中的，晃30分钟左右。

滤纸开始是买的那种专用滤纸，上面三张，下面三张，后来有人说这种滤纸是做湿转用的，应当用那种比较厚的，上下各一张，我也不知道，后来就换成普通滤纸了，上下大约各15张左右，有时着急还反复用过，效果也还可以，估计问题不大。

因为这款半干转膜仪说明书上说不会短路，所以一般滤纸?

膜?

胶.他们之间一定不要有气泡.。

膜上要做好标记，识别正反面和上下,切个小角是常用的方法,有MARKER也方便记.

转膜后的胶可用考染看看转膜情况.

考马斯亮蓝R250:

R250,甲醇50ML,冰乙酸40ML,加水到100ML.

脱色液:

乙酸50ML,甲醇225ML（可用乙醇）,ddH2O500ML

10*丽春红（20ML）:

2%丽春红（）,30%三氯乙酸（6克）,30%磺基水杨酸（6克）.用时参加9倍的ddH2O

10*转膜缓冲液:

70KD分子量:

Tris29克,甘氨酸,SDS,加水到500ML.

用时取10ML,加20ML甲醇,加70ML双蒸水

17KD分子量:

Tris29克,甘氨酸,加水到500ML.

用时取10ML,加50ML甲醇,加40ML双蒸水

封闭

用5%的封闭液（伊利的高钙脱脂）,室温,摇床1小时.

5%封闭液:

1克脱脂奶粉,20ML洗膜液.

洗膜液:

10*PBS50ML,450MLddH2O,0.5MLTWEEN-20

抗体.

杂交液:

BSA,洗膜液50ML.4度保存,如有混浊,重配.

ECL显影

将膜上多余的水吸干,与胶相邻的一面向上,按ECL说明书配置发光液.点在膜上.

不同厂家ECL要求不一样,本人用的ECL二种液体1:

1混合后,0.125/CM2,放置2分钟,吸干（可以用微量加样器抽回来,可连续用下一张膜）,放在保鲜膜上,包好,压片.

假设肉眼可见发光,可压10-20秒;假设看不到,可压30分钟.（再长的时间没试过,一般30分钟不出,就重新再回一次ECL,重做一次,假设再不出,就认为没有了.）

转完膜后的膜假设不能及时做,可放在洗膜液中,4度保存,最多放过2天,时间长了就不知道了.

小分子量的蛋白半干转效果比较好，

大分子量〔100KD〕以上建议湿转。

详细转膜条件需要多摸一下。

30-80KD半干转恒流1mA/cm2，1-1.5h都可以，大分子湿转100V，2.5h以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。

湿转，Buffer一定要预冷，最好提早一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。

显影:

转膜后看和你的蛋白分子量近似的预染Marker有没有转过去，假设marker没问题，那根本可以认为你的蛋白转过去了。

显色的话应该ECL好些吧，灵敏度更高呢，HRP标记的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL试剂，包好后压片，一般假设你可以看到荧光的话，压片5min以内就可以看一下，假设看不见的话，直接压半小时吧。

暗室中压片，压片完后显影、定影、水洗，就可以了。

要是对曝光时间没有把握，可以一次叠两张胶片，相当于做个梯度。

蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较适宜？

解答：

分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。

干转的话，用2.5A/cm2，30min就应该够了。

湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。

转膜时何为湿法，何为半干法？

解答：

半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法

半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好似都有关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？

一般的条件是怎样的？

解答：

半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。

western显色的方法主要有以下几种：

i.放射自显影

ii.底物化学发光ECL

iii.底物荧光ECF

iv.底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同程度和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下〔二抗用HRP标记〕：

反响底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

DAB好还是ECL好？

答：

DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但假设到达阀值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。

要看你实验的情况。

westernblot的实验步骤及本卷须知的资料

1.把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。

1〕转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。

2〕在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸〔预先用转移缓冲液浸湿〕，将凝胶夹在中间，保持潮湿和没有气泡。

3〕将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。

4〕将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以吞没凝胶。

5〕按照厂家所示接通电源开始电泳转移。

6〕转移完毕后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。

2.将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。

3.用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。

4.膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。

5.室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。

6.用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。

7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。

8．混合：

NGS（100微升），印迹缓冲液中的抗体〔10毫升〕，加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时〔或4℃过夜〕

9．用总体积300mlPBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。

10．将连接生物素的羊抗兔IgG〔40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS〕加在袋内，于室温下摇动1小时。

11．按步骤9洗涤。

12．参加抗生素蛋白-HRP〔40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS〕，于室温下摇动。

本卷须知：

westernblot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间构造改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于westernblot检测。

这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进展westernblot。

实验中取胶和膜需带手套。

western blot试验心得

前两天做了一个westernblot,如今把试验中的一点小小的体会发上来，与大家交流，希望大家多多指点！

1本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。

所以本人的试验结果中出现了小斑点。

建议最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进展封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较好。

2本人采用的是过夜封闭方法，虽然时间长，想想封闭效果应该是没有什么问题，但是一定要注意封闭液是否盖过了全部的膜，不要漏掉任何一个小角落哟。

3洗膜的时候，最好将膜放在平皿中，置于程度的试验桌面上，不时用手晃动一下平皿，这样洗膜会比在脱色摇床上更完全。

因为在脱色摇床上晃动，有时洗涤液缺乏以完全没过膜，在最后显色的时候，会发现液体流过的一道道痕迹，使背景值增加。

4其实在westernblot中，以上操作都是小问题，最主要的是一抗的质量和待检测蛋白的提取质量。

在试验之前，最好先用阳性对照与一抗做免疫学沉淀检测〔如ELISA〕，看看其效价和质量，以便确定在后来的杂交试验中一抗的选择和加量。

另外，在做杂交之前最好也先跑一块PAGE胶，染色，检测一下待检蛋白的提取质量。

5在加一抗温育之前，最好先将等量的一抗与野生型〔即阴性对照〕的蛋白在37摄氏度作用30分钟，这样可以封闭掉一抗的一些非特异性结合位点。

6一定不要忘记做阴性对照和阳性对照，特别是阴性对照，不然结果出了什么问题，就无从分析了。

7全程做下来，最后的显色就像是个一锤定音的时刻，分外冲动，但也应该尤为专注，一旦目的条带出现了，就要马上对显色进展终止，要不然杂带就要出来了。

主要试剂

1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热（以利于溶解双丙稀酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和1%（w/v）N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

）储于棕色瓶，4℃避光保存。

严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反响是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。

如有沉淀，可以过滤。

2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:

10%（w/v）0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、 别离胶缓冲液:

1.5mmol/LTris-HCL（pH8.8）:

18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。

过滤后40C保存。

4、 浓缩胶缓冲液:

0.5mmol/LTris-HCL（pH6.8）:

6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。

过滤后40C保存。

这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。

PH太低时，聚合反响受到抑制。

10%（w/v）过硫酸胺溶液。

提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。

去离子水配制数ml，临用前配制.

6、 SDS-PAGE加样缓冲液:

pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O32ml混匀备用。

按1:

1或1:

2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:

30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。

临用前稀释10倍。

8、 转移缓冲液：

配制1L转移缓冲液，需称取甘氨酸、5.8gTris碱、SDS，并参加200ml甲醇，加水至总量1L。

9、 丽春红染液储存液：

丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。

使用后应予以废弃。

10、 脱脂奶粉5%（w/v）。

11、 NaN30.02%叠氮钠（有毒，戴手套操作），溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS）。

12、 Tris缓冲盐溶液（TBS）:

20mmol/LTris/HCL（pH7.5），500mmol/LnaCl。

13、 Tween20（15）鼠抗人-MMP-9（16）鼠抗人-TIMP-1。

14、 过氧化物酶标记的第二抗体。

15、 NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。

16、 BCIP（溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。

17、 100mmol/LTris-HCL（pH9.5）。

18、 100mmol/LNaCl。

19、 50mmol/LTris-HCL（pH7.5），5mmol/LEDT