动物细胞培养常用方法.docx

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动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cellproliferatinalcycle）概念

细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。

而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。

细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。

根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。

如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。

M期完成遗传物质的分配。

因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。

二.培养细胞生命期（lifespanofculturecells）

很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。

索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。

培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。

人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。

如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。

只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。

正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：

原代培养期、传代期、衰退期。

三.培养细胞一代生存期

培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。

每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。

传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。

接种细胞数量大，细胞基数大。

相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。

以上情况都会缩短传代时间。

所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞时代或倍增非同意含义。

如某一细胞系为第20代细胞，即指该细胞系已传代20次。

在细胞一代中，细胞能倍增3~6次。

细胞传一代后，一般要经过以下六个阶段：

游离期、贴壁期、潜伏期、指数增长期、停滞期、衰退期。

四.无菌操作要求

（一）实验前培养室和超净台的消毒。

在工作台面消毒时，切勿将培养细胞和培养用液用紫外线照射；工作台面上的用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果；一些操作用具，如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦拭后置台内同时紫外线照射消毒。

（二）无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其他实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。

试剂瓶口和外壁要用75％酒精擦拭后才能带人无菌操作台内。

超净台上的物品布局要合理，污物废液缸、酒精棉球缸在右侧位，酒精灯在中央区，试剂瓶在左侧位。

实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。

（三）洗手和着装：

严格按照外科手术要求消毒着装，双手用肥皂洗净后，浸泡于消毒液中，并用75％的酒精擦拭。

（四）操作中，小心取出无菌实验用品，避免造成污染。

尽量减少手与器材的接触面，学会手指操作。

手指不能触及器材使用端及容器瓶口，如触及，需要更换或烧灼后再使用。

组织、细胞及培养板在未做处理和使用前，不要过早暴露于空气中。

（五）一切操作，如打开或封闭瓶口，安装吸管、注射器等，都要在酒精灯火焰前方进行。

瓶口、吸管、注射器等使用前要经过火焰烧灼后使用。

但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火c另外，胶塞、橡皮乳头及塑料制品等细胞培养用品过火焰时也不能时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害细胞。

（六）试剂瓶顺风斜放在支架上，培养瓶、培养液瓶不要过早打开。

容器打开后，用手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量避免垂直放置以防止下落细菌的污染。

吸取液体前，瓶口和吸管应行火焰消毒，吸取液体时避免瓶口和吸管碰撞。

吸管不能混用，吸过培养液的吸管不能再烧灼，因残留在吸管内的培养液成分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带到培养基中。

不要在打开的容器正上方操作。

瓶口液滴不能倒回瓶内，液滴用于酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。

（七）不同的细胞同时操作时，要专管专用，并要勤换吸管，防止扩大污染和细胞交叉污染。

（八）操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。

不要面向操作台讲话或咳嗽，避免唾沫将微生物带人超净台内，污染空气。

同时应注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台（至少两级）。

操作过程中小心有毒性试剂，例如DMSO及TPA等。

实验者离开超净台时，立即用肘关节关闭侧窗口，避免无茵室内细菌随空气流人净化操作区。

五.高压蒸汽灭菌装置

（一）使用方法

1.首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

2.放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。

注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。

三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

3.加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。

再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4.通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。

待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。

当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

5.到达灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降而发生意外事故。

（二）注意事项

1.消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止意外事件发生。

消毒完毕后从压力蒸汽消毒器中取出的消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60℃~70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易被微生物污染。

但如果消毒物中有液体时，一定要待消毒器冷却后方可打开消毒器的盖，不能先打开阀门放气，否则液体会溢出。

2.不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。

平衡盐溶液及其他需要灭菌的液体：

121℃，10磅（68.95kPa），20min；布类、玻璃制品、金属器械等物品：

121℃，15磅（103.42kPa）、20min。

六.使用血清的注意事项

血清的质量、种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的牛长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。

因此，在购买大量血清之前，必须对血清支持细胞生长能力进行检测，包括接种率、生长曲线、维持细胞特性、无生物污染性等方面，然后再大量购买质量好的同一批号的血清，并注意以下几点：

（一）需要长期保存的血清必须储存于-20℃或-70℃低温冰箱中，同时应避免反复冻融。

4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。

由于血清结冰时体积会增加约10％，因此，血清在冻入低温冰箱前必须预留一定的体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。

（二）一般厂商提供的血清为无菌，无需再过滤除菌。

如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。

（三）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：

-20℃或-70℃低温冰箱中的血清放人4℃冰箱中溶解1d，然后移入室温，待全部溶解后再分装。

在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。

切勿直接将血清从-20℃或-70℃直接放人37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。

（四）热灭活是指56℃，30min加热已完全解冻的血清。

加热过程中需规律摇晃均匀。

此热处理的目的是使血清中的补体成分灭活。

除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会产生其他不明效应。

究竟灭活与否，以有利于实验为主。

切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，黏度增大，同时血清中的有效成分会被破坏而影响血清质量。

（五）血清中的絮状物主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中的纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。

可3000r/min，离心5min去除，也可不用处理。

（六）采购血清时，最好先从供应商处索取样品进行试验，选定一批后就要保留足够使用6个月至1年的量，直至用到另一批经过预先试验的样品代替。

七.基本培养基的应用

基本培养基只能维持细胞的生存，想要使细胞生长和增殖，还需补充部分天然培养基和一些补充成分，效果才更好。

主要是牛血清、谷氨酰胺等。

此外，为防止污染，还经常加一定的抗菌素。

补加了上述物质的培养基叫完全培养基。

按其血清量的多少又分为生长液和维持液。

由于培养液是细胞赖以生存的环境，制备过程要操作严格，避免混入杂质。

使用的成分应精心选择，必须用质量最优的试剂，容器要仔细清洗和消毒。

八.合成培养基的保存

（一）液体培养基的保存：

液体培养基应于4℃冰箱避光保存，实验前放入37℃预热。

液体培养基中的L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解。

如果细胞生长不良，可以再添加适量L-谷氨酰胺。

液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的PH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会对细胞生长不利。

故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月至一年。

（二）干粉培养基的保存：

4℃冰箱避光保存，有效期36个月。

九.平衡盐溶液（BalancedSaltSolution，BSS）

平衡盐溶液是细胞培养中常用的基本液体。

它主要是由无机盐、葡萄糖组成，其作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。

主要用于合成培养基的基础液、取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配置其他试剂等，最简单的BSS是Ringer。

平衡盐溶液的种类很多，常用的几种见表。

各种平衡盐溶液的主要区别在于氯化钠的浓度、离子的浓度及缓冲系统不同，可根据需要选用适当的个衡盐溶液。

最常用的BSS是D-Hank’s、Hank’s、Earle液。

D-Hank’s和Hank’s的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank’s常用于配制胰酶溶液。

Hank’s和Earle液的主要区别是缓冲能力个同，Earle液含会高浓度的NaHCO3（2.2g/L），缓冲能力较强，适合于5%C02的培养条件，在空气水平的C02中，，溶液会变碱，Hank’s液仅含有0.35g/LNaHCO3，缓冲能力较弱，不能用于5%C02的环境，若放入C02培养箱，溶液将迅速变酸．使用时应注意。

平衡盐溶液中一般加有少量的酚红作为溶液酸碱度的指示剂，以便于观察培养液pH的变化。

溶液中性时为桃红色，偏酸时呈黄色，偏碱时则为紫红色。

配制平衡盐溶液应使用双蒸水。

如果配方中含有Ca2+、Mg2+，应省首先溶解这些成分。

配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。

一十.消化液

进行原代培养时常常需要用消化液将组织块消化解离形成单细胞悬液，传代培养时也需要用消化液将贴壁细胞从瓶壁上消化下来，常用的消化液有胰蛋白酶（Trypsin）溶液和二乙烯四乙酸二钠（EDTA）溶液，有时也用胶原酶（collagenase）溶液。

（一）胰蛋白酶溶液

胰蛋由酶是从动物胰脏分离的一种水解酶，其主要功能为使细胞间的蛋白质水解和细胞分散。

胰蛋白酶的活性可用消化酪蛋白的能力表示，常用的有1：

125和1：

250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。

胰蛋白酶分散细胞的能力与细胞种类及细胞特性有关，适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。

对传代培养细胞效果也很好。

但对于纤维性组织和较硬的癌组织效果差。

不同种类的细胞以及不同数量的细胞采用胰蛋白酶消化的时间也不相同。

另外，胰蛋白酶浓度大、作用温度高、时间长时，对细胞分离能力也大，但超过一定的限度会损伤细胞。

新配置的胰蛋白酶可使细胞分散速度增快。

细胞培养用胰蛋白酶溶液一般配制成0.25%~0.125%的浓度，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液（如前面的D-Hank’s），因为Ca2+、Mg2+是细胞膜的重要组成成分，它们能促使细胞凝集，有阻碍消化的作用；血清会对胰蛋白酶产生抑制作用。

因此，也常用含血清的培养液终止胰蛋白酶的消化作用。

胰酶作用及溶解的最佳PH是8~9，配制胰酶溶液应将液体调至pH8左右，充分溶解，过滤除菌。

过滤后可以再调至PH7．5，也可不调。

（二）EDTA溶液

EDTA是一种化学螯合剂，能整合Ca2+和Mg2+，溶液毒性小，使用方便，也常用来解离细胞。

它的作用机制是，一些细胞尤其是上皮细胞在生长过程中需Ca2+和Mg2+，参与细胞的连接，维持组织的完整性，而EDTA从细胞生存环境中夺取Ca2+和Mg2+，并与这些离子形成螯合物，从而使细胞分离。

因此，对于一些贴壁特别牢固的细胞，可以用EDTA和胰酶的混合液（1：

1）进行消化，提高消化率。

注意：

使用EDTA处理细胞后，一定要用Hank’s液冲洗干净，一是由于残留的EDTA可损伤线粒体，它与核蛋白中的Ca2+和Mg2+结合，破坏核蛋白结构，且细胞长期处于无Ca2+的环境中，K+浓度降低，细胞呼吸减弱，从而影响细胞生长。

二是由于EDTA作用不受血清抑制。

另外，胶原酶的消化作用依赖于Ca2+，因此，EDTA不可与胶原酶联用。

一十一.抗菌素溶液

常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液”。

青霉素主要是对革兰氏阳性菌有效，链霉素丰主要对革兰氏阴性菌有效。

加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。

配制时用10mL三蒸水溶解1.0×l06μg/瓶的硫酸链霉素，取8mL硫酸链霉素液溶解8.0×l05IU/瓶的青霉素粉，即成青、链霉素各1.0×105IU/mL的母液。

使用时，100mL培养基内加母液0.1mL，这样培养基内青、链霉素的最终浓度为各100IU/mL。

有时为防止支原体和霉菌污染，要用到卡那霉素液、制霉菌素或两性霉素B。

卡那霉素的配法：

将一瓶卡那霉素（5.0×104μg/瓶）溶于5mLHank’s液中，即成1.0×104μg/mL母液。

使用时每100mL培养基内加0.5mL母液，最终使用浓度为50μg/mL。

制霉菌素不能溶于水，故只能配成5000IU/mL悬液。

使用时每100mL，培养基内加0.5mL母液，最终使用浓度为25IU/mL。

在实际工作中，选择哪一种抗生素、剂量多少、何时加入等，与污染源、抗菌素的抗菌范围、抗菌素的稳定性等有密切关系，应灵活运用。

需要特别注意的是，抗菌素液配制对要无菌操作、小量分装、-20℃冻存。

一十二.细胞计数

原代细胞制备时．培养的细胞要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。

计数结果以每毫升细胞数表示。

细胞计数是细胞培养中一项基本技术，是了解培养细胞生长状态以及测定培养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。

细胞计数主要利用血球计数板来完成。

血球计数板的每一大方格长为1mm，宽为1mm，高为0.1mm，体积为0.1mm3，可容纳的溶液是0.1μL，每lmL溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格数出的细胞数的10000倍。

（一）准备计数板：

用酒精清洁计数板和盖玻片，然后用吸水纸轻轻擦干；

（二）准备细胞悬液：

用0.25%胰蛋白酶消化单层细胞或收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。

要求细胞密度不低于104个/mL，若细胞数很少，应将悬液离心（1000r/min，5min），重悬浮于DMEM培养基中；

（三）加样：

将盖玻片盖在计数板两槽中间。

用微量移液器轻轻吹打细胞悬液，吸取少量细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧边沿加细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。

否则要将计数扳和盖玻片擦干净重新加样。

（四）计数：

在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。

细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。

一十三.细胞传代培养

（一）细胞在培养过程中随着数量的增长，尤其细胞生长十分旺盛时，代谢产物堆积，C02增多，培养基的营养成分枯竭，一方面长满培养空间，另一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度逐渐减慢甚至停止，更换培养基也不能使细胞继续生长，这种情况下，为使细胞能继续生长，都需要将其分成小的部分，重新接种到另外的培养器皿内，再进行培养，这个过程被称为传代培养。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

细胞长满80%~90%或刚刚全部汇合是细胞传代的理想时期，过早细胞产量不足，过晚细胞健康状态不佳。

（二）将分装好的细胞培养物置37℃、5%C02培养箱内培养，必要时可于2~3d后换1次生长液，类上皮细胞在5~7d后可长成单层细胞，成纤维细胞则以3~4d或5~7d为宜。

单层细胞已铺满瓶皿底面时，如继续培养，则易老化，甚至脱落；感染病毒等可影响特异性细胞病变效应的判断，因此成片细胞不能当天使用对应换成维持液（不含或仅含2%以下血清的培养液），以后每隔5~7d换维持液1次，一般可维持1~3周。

（三）这种长成单层的细胞可进行传代培养。

细胞传代时，首先弃去培养瓶内旧培养液，加入5mL左右生理盐水，清洗细胞表面，然后向瓶内加入0.25%胰蛋白酶（或EDTA、胰酶-EDTA等），以能覆满瓶底为限，放置片刻，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大，细胞还未漂起时，立即终止消化，弃去消化液，用玻璃注射器吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液，计数板计数后，将细胞调整到5×105个/mI左右，并分成等份分装入若干培养瓶中（一般来说一瓶生长致密的细胞可以传3~4瓶），将细胞瓶置于CO2培养箱（37℃，5%C02）中继续培养。

观察消化程度也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。

对难于从培养瓶基层分离的细胞系，可以轻轻敲打，以加速分离过程。

也可在37℃孵育培养瓶，轻轻摇动培养瓶。

（四）对于悬浮生长的细胞可采用离心法传代，即1000r/min离心，去上清，沉淀物加入新培养液后再混匀传代。

也可用直接传代法，即让细胞自然沉降，上清弃去1/2~2/3，吹打成悬液再传代。

一十四.细胞冻存与复苏

（一）冻存：

采用液氮超低温保存（-196℃），冻存前24h更换新鲜培养液，使细胞处于充足的营养环境中。

常规法消化细胞，制备成细胞悬液后通过计数计算细胞总量。

以1000r/min离心10min弃上清再重复离心一次，尽量除去胰蛋白酶。

加入4℃预冷的冻存保护液（90%FBS+10%DMS0），调整细胞密度约3.0×l06个/mL。

每支陈存管中装约1mL后封口，标明日期、品种、细胞名称和培养代数。

冻存管置4℃~8℃使DMSO充分渗透到细胞内，平衡2h后移到液氮罐液氮面以上预冷，每隔一定时间向下降一定高度，约2h完全放入液氮罐底部，以后定期检查补充液氮，要完全杜绝细胞暴露在液氮外。

（二）复苏：

从液氮中取出冻存管，立即投入37℃~42℃水中快速晃动，直至完全融解，最好在90s内完成复温过程。

加入约10mL（50mL培养瓶）培养液置5%CO2培养箱中培养，2h~8h后换加等量的新鲜培养液以降低DMSO对细胞的损害作用。

根据实验进展情况，及时进行传代。

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（三）