版脊髓性肌萎缩症遗传学诊断专家共识全文Word文件下载.docx

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（2）临床检测：

包括血肌酶谱，肌酸激酶（CK）值正常或轻度升高，绝大多数患者不超过正常值的10倍，肌电图提示神经源性损害；

（3）基因检测显示SMN1外显子7纯合缺失或SMN1复合杂合突变，阳性结果可确诊SMA；

（4）基因检测阴性结果患者需行肌电图及肌肉活检，帮助诊断与鉴别诊断[11]（图1）。

SMA的临床分型主要依据患者起病年龄和获得的运动里程碑，并参考SMN2拷贝数（表1）。

部分患者的运动里程碑获得迟于健康个体，因此，建议对患者进行定期随访。

图1

SMA诊断流程图

2．SMA鉴别诊断：

当疑似患者的基因检测未见SMN1双等位基因致病变异，或症状不典型，或伴有非SMA临床表现时，进行以肌无力为主要症状的其他疾病的鉴别诊断非常必要。

6个月以下患儿需鉴别其他软婴综合征，6~18个月患儿需鉴别婴幼儿时期起病的神经肌肉病。

成年期患者需鉴别成人期起病的神经肌肉病。

因需鉴别的疾病种类繁多，常选择二代测序技术（NGS）及其他高通量诊断技术（表2）。

表2

SMA的鉴别诊断

致病机制与遗传学诊断基础

SMA为常染色体隐性遗传病。

致病基因SMN1（NG_008691.1）定位于5q13.2，转录本编号NM_000344.3，其编码的全长SMN蛋白（NP_000335.1）在各组织细胞广泛表达，参与剪接体蛋白复合体的组装，是真核细胞生物生存所必需的管家蛋白[14]。

SMN1双等位基因发生致病性变异通常导致SMA发生。

SMA病理生理学表现为脊髓前角α-运动神经元退行性病变和神经肌肉接头发育异常。

一、SMN1突变基因型和变异频率

98%的SMA患者的SMN1双等位基因变异分别遗传自双亲，2%患者有一个等位基因发生新生变异[15]。

SMA突变基因型主要有两类：

95%由SMN1双等位基因纯合缺失所致，即[0+0]基因型；

5%由SMN1复合杂合突变所致，即一个等位基因缺失，另一个等位基因发生微小致病性变异，为[0+1d]基因型。

SMN1双等位基因均为微小致病性变异，即[1d+1d]基因型，非常罕见，目前仅有白种人近亲婚配的病例报道。

SMN1缺失大部分为外显子7合并外显子8共同缺失，少部分仅为外显子7缺失。

由于外显子8位于非编码区，SMN1缺失通常指外显子7缺失。

SMN1微小致病性变异在不同种族患者中表现不同的变异谱系，目前国内外已报道的微小致病性变异约90种（http:

//www.hgmd.cf.ac.uk），中国患者已报道[16,17,18,19,20,21,22]近30种，其中检测频次≥2，并经美国医学遗传与基因组学学会（ACMG）致病性评估[23,24]确认为是致病性微小变异有7种（表3）。

表3

中国SMA较常见的微小致病性变异

二、SMN2表型修饰及临床意义

SMN2全长mRNA编码与SMN1相同的SMN蛋白。

SMN2与SMN1的序列同源性>

99.9%，两者仅存在5个碱基差异，其中在第7外显子第6位c.840的C/T，导致90%的SMN2mRNA外显子7被选择性剪接，仅有10%的SMN2表达全长有功能SMN蛋白[25]。

SMN1和SMN2均位于5q13.2，该区域存在包括SMN在内的多对同源基因导致基因组不均等的互换和基因转换，出现SMN1和SMN2拷贝数的多种变化。

在SMA患者中可以见到SMN1真实缺失，SMN1∶SMN2拷贝数通常为0∶2，约占中国SMA人群28%[16]；

还有SMN1转换为SMN2导致的SMN1缺失和SMN2增加，或者SMN1真实缺失伴随SMN2重复，这两类情况SMN1∶SMN2拷贝数为0∶3或者0∶4，约占62%[16]；

同时，SMN1和SMN2之间还存在部分转换，出现SMN1-SMN2融合基因，患者仅见SMN1外显子7缺失，外显子8不缺失，约占6%[16]。

在一般人群中正常个体的SMN1基因至少为1拷贝，而SMN2基因可以为0拷贝，绝大数个体的SMN1∶SMN2拷贝数为2∶2，但也有正常个体SMN1基因多于2拷贝。

SMN2拷贝数是目前公认的SMA修饰因子，患者携带SMN2拷贝数越多表型越轻，尽管其与表型的相关性不完全一致，在国内外管理共识中仍将SMN2拷贝数作为SMA诊断的标准步骤之一[2,7]。

一般认为，携带1个SMN2拷贝的患者是最严重的0型，宫内发病，出生后1个月内死亡；

携带2个SMN2拷贝的患者通常为1型，大部分在2岁前死亡，早期给予药物治疗及呼吸和营养支持可降低死亡率；

携带3个SMN2拷贝的患者主要为2型和3型，需要药物治疗和前瞻性干预及定期随访；

携带4个SMN2拷贝数的患者通常为4型，发病晚，病情进展缓慢[26,27]。

SMN2拷贝数在以调控SMN蛋白为治疗策略的药物临床试验中常常被作为重要参考数据[28]，而在新生儿筛查中则被作为症状出现前患者治疗评估的重要生物学标志物[9]。

三、携带者及人群携带率

SMA携带者指表型正常但一条染色体上的SMN1基因功能正常而另一条染色体的SMN1基因存在致病性变异的个体。

在正常等位基因中，将携带1个SMN1基因拷贝定义为1拷贝（1-copy）；

将携带2个SMN1基因拷贝定义为2拷贝（2-copy）。

在致病等位基因中，将携带SMN1缺失或因转换导致的SMN1缺失定义为0拷贝（0-copy）；

将携带微小变异的SMN1基因定义为1d[8]。

因此，SMA携带者的SMN1基因型主要分为4种：

[1+0]基因型，即外显子7拷贝数为1，该携带者的一条染色体上SMN1功能正常，另一条染色体上存在SMN1缺失或转换；

[2+0]基因型，即SMN1外显子7拷贝数为2，该携带者2个功能正常的SMN1基因拷贝位于同一条染色体，另一条染色体上存在SMN1缺失或转换；

[1+1d]和[2+1d]基因型，即SMN1外显子7拷贝数≥2，一条染色体上的SMN1功能正常，并且拷贝数为1或2，另一条染色体上的SMN1基因存在微小变异而功能异常[8]。

世界范围内SMA携带率为1/100~1/45[1]，亚洲人群携带率约为1/48。

一般人群中，[1+0]、[2+0]、[1+1d]和[2+1d]基因型的人群频率分别为2.58×

10-2、1.09×

10-3、4.72×

10-4和1.99×

10-5[29]。

而在肯定携带者人群中[2+0]频率约为4%[30]，[1+1d]频率约为5%[16]。

基因诊断

SMN1发生双等位基因的致病性变异是SMA诊断的主要依据，临床诊断或临床疑似SMA的患者均应进行基因检测确诊。

检测的目标基因为SMN1和SMN2。

其中SMN1拷贝数和致病性变异的检测结果用于疾病诊断或排除诊断，SMN2拷贝数的检测结果作为患者诊断后的治疗、临床管理和预后评估的参考指标。

一、基因诊断原则

SMA基因诊断应满足各种SMN1突变基因型患者的诊断，包括SMN1纯合缺失患者，即[0+0]基因型；

以及SMN1基因复合杂合突变患者，即[0+1d]基因型：

（1）在人类基因组中SMN1与SMN2高度同源，基因诊断技术须分别针对SMN1和SMN2。

SMN1与SMN2全长转录本在外显子7（c.840C/T）和外显子8（c.*239G/A）的差异碱基位点作为区分两个基因座的主要参考位点。

（2）SMN1与SMN2均存在多个转录本，为减少致病性变异的误判，推荐SMN1NM_000344.3和SMN2NM_017411.3全长转录本分别作为SMN1与SMN2基因分析的参考序列。

（3）应用定量分析技术进行基因检测时，建议同时报告SMN1和SMN2的拷贝数。

（4）基因诊断明确的患者，其父母有必要进行SMN1检测，以便确定父母SMN1基因型和患者变异基因的来源，进行遗传咨询。

二、基因诊断流程：

由于95%的SMA患者为SMN1外显子7纯合缺失，应首先进行SMN1拷贝数定量分析。

当受检者为SMN1外显子7或外显子7与8纯合缺失，即可诊断为SMN1纯合缺失型患者。

当受检者为SMN1杂合缺失，提示需进行另一个SMN1等位基因的序列分析：

如检测到微小致病性变异，该个体诊断为SMN1缺失和微小变异的复合杂合突变患者；

如未查到微小致病性变异且临床表现又不典型，该个体可能仅为SMN1缺失携带者，可能是其他疾病患者，需进一步鉴别诊断。

当受检者没有检测出SMN1纯合缺失或复合杂合变异，但具有明确的SMA临床诊断，则可能存在检测范围外的致病性变异，特别当患者父母为近亲婚配时，应进行SMN1基因全序列分析，以确诊SMN1双等位基因均为致病性微小变异的患者。

基因诊断流程见图1。

三、SMA相关的基因诊断技术

（一）拷贝数检测技术

1．多重连接探针扩增（MLPA）：

MLPA方法针对SMN1与SMN2基因第7和第8外显子碱基差异位点（c.840位点C/T和c.*239位点G/A）设计杂交探针，采用其他染色体位点的多个管家基因作为内参基因，以SMN1∶SMN2不同拷贝数的样本作为平行对照，在完成杂交连接等系列反应后，根据荧光峰面积的比值比来判断目标基因序列的拷贝数。

MLPA技术通过直接检测SMN1拷贝数，明确区分患者、携带者及正常人；

还可同时检测患者的SMN2拷贝数，是目前国内外SMA管理共识推荐使用诊断SMA的金标准[2,7]。

但是该方法不能检测SMN1基因微小变异与SMN1[2+0]基因型。

2．荧光定量PCR：

主要原理是通过多重实时荧光定量PCR反应，以管家基因序列为内参，采用Taqman探针法分别对SMN1基因第7和第8外显子进行拷贝数相对定量，来判断是否发生缺失变异。

该方法优势是操作简便、成本低廉，适用于人群筛查，但其特异性相比MLPA方法略逊，且SMN2拷贝数需要另外设计探针进行检测。

同样不能检测SMN1基因微小变异和[2+0]基因型。

（二）SMN1微小变异检测技术

SMN1复合杂合突变患者需要确认发生在SMN1基因的微小变异。

由于SMN1和SMN2高度同源，通常采用SMN1特异性长片段PCR结合巢式PCR的方法或SMN1基因逆转录（RT）-克隆测序进行SMN1的变异分析。

1．SMN1特异性长片段PCR结合巢式PCR：

根据SMN1和SMN2差异碱基，设计等位基因特异性引物用以特异性扩增整个SMN1来源的基因组DNA序列，再以长片段扩增产物作为模板通过巢式PCR扩增每个外显子及邻近的内含子进行序列分析，检测SMN1序列是否存在基因变异。

可以检测SMN1外显子和邻近内含子区域的微小变异。

2．RT-克隆测序方法：

提取患者外周血总RNA，逆转录后非特异性扩增全长SMN基因（含SMN1和SMN2）cDNA，根据SMN1和SMN2差异碱基挑选SMN1克隆，通过Sanger测序的方法检测来源于SMN1cDNA的基因变异。

该方法可以检测外显子的变异，也可以检测内含子区域影响剪接的变异的异常转录本，但是不能检测到调控区域的变异。

3．常规Sanger测序：

因操作简便，可用于筛查SMN1杂合缺失患者是否存在SMN基因微小变异。

但因该方法无法区分微小变异发生在SMN1还是SMN2，需要进一步验证。

（三）NGS

由于高通量且商业化，NGS已成为单基因遗传病基因诊断的首选技术。

由于SMN1和SMN2基因高度同源性，并且存在因相互部分转换形成的SMN1-SMN2融合基因，而目前的测序技术读长短（比如Illumina测序平台读长为100-150bp），因此NGS数据的常规比对拼接方法无法区别SMN1和SMN2基因的变异，gnomAD数据库内关于SMN1基因变异位点的信息描述也说明这个事实。

但由于SMN1和SMN2基因存在2个碱基差异位点（exon7的c.840C/T；

exon8的c.*239G/A），实验室可利用该位点的碱基类型的read比例来推测SMN1基因是否存在杂合或纯合缺失，但无法确定SMN1基因缺失长度和SMN2基因拷贝数。

2017年一项研究证实通过改进实验操作和生物信息学分析流程[31]，NGS可同时检测SMN1基因拷贝数和筛查SMN基因微小变异。

与MLPA技术相比，其检测SMN1基因拷贝数变异的灵敏度可达100%，特异性可达99.6%，但应用该技术筛选出的微小变异未能直接明确存在于SMN1或SMN2基因。

2020年，另一项研究也建立了用于筛查SMN1和SMN2拷贝数的NGS，应用已知阳性病例通过MLPA技术验证，该技术准确率达到100%[32]。

值得注意的是，以上两项研究均将SMN1和SMN2基因（chr5∶70220768-70248838和chr5∶69345350-69373418）都作为靶向区域筛选变异，基于SMN1和SMN2基因的差异性位点对常规测序和生物信息学流程进行改进，使用已知阳性样本的NGS数据作为内标构建SMN1基因的拷贝数计算公式。

以上研究表明，NGS直接计算SMN1拷贝数的技术将逐渐成熟和准确，但筛查或诊断SMN1微小变异仍存在很大困难。

目前在我国，NGS尚未成为SMA的常规检测方法，但是其适用于SMA鉴别诊断，即对非5qSMA的神经肌肉病，或者以肌无力为临床症状需要排除诊断的患者开展致病基因变异筛查。

如果诊断实验室只是利用SMN1和SMN2基因的差异位点来推测SMN1基因的杂合或纯合缺失，而没有如以上文献建立SMN1基因拷贝数变异的计算方法，则必须使用经典拷贝数诊断方法（比如MLPA）进行验证。

如果利用NGS筛查SMN1基因的微小变异，则需要说明如何确定该变异发生在SMN1基因。

（四）其他检测技术

SMA传统的检测方法还有双侧双重等位基因特异性PCR（AS-PCR）与聚合酶链反应-变性高效液相色谱（PCR-DHPLC）等。

对于不具备定量检测技术条件的检测机构可以应用定性检测技术诊断SMN1外显子7纯合缺失病例，例如PCR-酶切分析或者Sanger测序等。

但定性检测技术不能检测SMN1基因的杂合缺失，可能导致复合杂合突变患者的漏诊或误诊。

四、基因诊断报告要点

1．基本信息：

包括被检测者的个体识别信息，如姓名、性别、出生日期、采集样本时间、样本性质、门诊号及住院号、送检医生信息等。

2．病历信息：

包括患儿症状、体征、辅助检查结果和临床诊断。

3．基因检测方法：

应说明使用的检测方法、检测试剂名称和型号、列出检测方法的适用范围、检测技术的局限性。

还应说明SMA的基因型分布的背景资料。

4．检测的目标基因：

检测的基因名称、基因组位置、基因的转录本号。

5．检测结果和结果解读：

（1）拷贝数检测报告应包含如下信息：

SMN1基因和SMN2基因外显子7和外显子8的拷贝数；

（2）基因微小变异分析报告或基因序列分析报告应包含如下信息：

SMN1微小变异信息、遗传模式、变异来源、致病性分析等；

（3）建议拷贝数和基因微小变异的检测结果报告以表格形式报告，并提供原始的实验结果图。

6．SMN1变异的致病性分析和命名：

SMN1基因外显子7拷贝数缺失为明确的致病性变异，单碱基或几个碱基的微小变异建议参照ACMG制定的基因变异解读指南[23]，将变异的临床意义依据评估证据进行五级分类：

致病性、可能致病性、临床意义不明、可能良性和良性。

致病性和可能致病性变异通常认为是导致疾病发生的变异，临床意义不明变异建议结合临床诊断进行后期数据重分析。

对于测序发现的未报道、变异，尤其错义变异，由于缺乏SMN1基因区域的正常人群频率，致病性评估中PM2证据可能无法使用。

致病性变异命名参照国际变异命名网站（http:

//varnomen.hgvs.org/）的标准。

7．检测结论和建议：

检测报告应给出明确的检测结论。

如本检测方法不能完成患者基因诊断，则应给出是否需要进一步验证以及验证方法的建议。

五、基因诊断后的临床管理和遗传咨询

首先判读基因检测报告是否明确了患者的基因型及变异的致病性等，检测结果是否可以解释患者的临床表现，确认遗传学诊断的有效性。

对患者及时进行临床分型及病情评估，解释疾病的发生发展，开展药物治疗、多学科管理和定期随访。

延长患者生存周期，提高运动功能，延缓和减轻并发症的发生发展。

提供患者及监护人遗传咨询，包括：

遗传病因、传递模式、再发风险评估、产前诊断或植入前遗传学检测等再生育选择以及家庭成员携带者筛查建议等相关信息和指导（图1）。

产前诊断

由于SMA的病情严重、治疗费用昂贵，现阶段产前诊断仍然是SMA主要的预防手段。

1．SMA产前诊断原则：

SMA的产前诊断应在具备产前诊断资质的医疗机构由具有资质的专业人员进行。

实施产前诊断之前必须预分析或验证先证者及父母的变异基因型，明确先证者的SMN1变异类型，据此制定该家系实施产前诊断的策略和诊断技术。

产前诊断通常在母孕的早、中期采集胎儿绒毛组织或羊水细胞进行检测。

2．SMA产前诊断的对象：

（1）生育过SMA患儿的夫妻；

（2）夫妻双方均为SMA携带者；

（3）生育过临床诊断SMA的患儿，但患儿夭折前未行基因诊断，再生育前通过SMN1基因检测明确双方为SMA携带者的夫妻。

3．产前诊断的基因和基因型：

SMA产前诊断的检测基因为SMN1。

由于SMN1基因的特殊性，大部分产前诊断机构仅针对SMN1缺失型SMA进行产前检测；

复合杂合变异的SMA家庭行产前诊断前应到有检测SMN1微小变异经验的实验室进行微小变异的确定，再进行产前检测。

对于SMN1缺失型SMA，要参考父母的基因型对胎儿进行基因型判断。

当父母皆为[1+0]基因型，胎儿为SMN1纯合缺失型时诊断为SMA受累胎儿。

建议进一步检测SMN2的拷贝数，在产前遗传咨询中可以给予胎儿父母更多关于SMA临床表型信息，帮助他们对胎儿去留进行决策[33,34]。

当胎儿SMN1为1拷贝时，诊断为缺失型携带者，表型正常。

当胎儿SMN1为2拷贝时，孕胎为基因型和表型正常的个体。

如果父母之一基因型为[2+0]时，胎儿SMN1虽有2拷贝，胎儿仍为[2+0]型携带者个体，只有拷贝数为3时，胎儿才是正常个体。

4．SMA产前诊断的技术和局限性：

SMN1缺失型SMA产前诊断推荐采用MLPA或qPCR技术对胎儿进行SMN1基因拷贝数分析。

这两个方法均为拷贝数剂量的检测，检测范围有一定的局限性：

（1）如果没有父母的基因型数据，无法检测胎儿新生的SMN1微小变异；

（2）无法检测胎儿为SMN1[2+0]基因型的携带者；

（3）无法检测胎儿SMN1缺失的低比例嵌合体。

需要注意的是，由于SMA以SMN1纯合缺失型为主，母源污染是导致错误产前诊断的重要根源。

对绒毛组织要尽可能去除可能的母源组织，当羊水有血性污染时要进行细胞培养，无论是绒毛还是羊水均应同时以STR或SNPs为标记进行连锁分析，排除母源污染的可能。

5．SMA产前诊断前后的遗传咨询[34]：

产前诊断前的遗传咨询需告知以下要点：

（1）SMA产前诊断的目的是了解孕胎携带致病基因的情况。

孕胎产前诊断的可能结果包括正常个体、携带者或受累胎儿。

获得产前诊断结果后胎儿的取舍由其父母知情选择。

（2）SMA为常染色体隐性遗传病，父母均为携带者时，每次生育SMA患儿的再发风险为25%，男女患病机会均等。

SMN1[1+0]和[2+0]基因型携带者家庭的再发风险和产前诊断策略相同。

（3）产前诊断的基因检测范围仅限于检测SMN1和SMN2基因的拷贝数或某个特定的微小变异；

（4）产前检测所用的方法及原理，方法的敏感度、特异度、局限性和准确度；

（5）胎儿取材的种类和时间，产前诊断的价格和报告时间；

（6）还要特别告知，产前诊断取材中可能会无法避免母源污染，有需要重新取材的可能；

（7）获得SMA产前检测报告后需进行遗传咨询。

产前诊断后的遗传咨询主要包括：

（1）针对目前检测结果是否还需进一步的检测；

（2）告知产前检测结果，如为受累胎儿，告知疾病相关信息；

（3）当胎儿诊断为SMA受累胎儿并选择出生时，应给予相关治疗和干预措施等医学信息和建议；

（4）需要强调SMN2的拷贝数与胎儿出生后的临床表型不完全相关，SMN2拷贝数仅作为胎儿临床表型预测的参考。

植入前遗传学检测

胚胎植入前遗传学检测（PGT）是指将辅助生殖技术（ART）和遗传学分析技术相结合，对生育遗传病患儿高风险家庭进行胚胎活检和遗传检测，选择已知疾病不受累的胚胎植入子宫从而获得健康的子代。

一、SMA的PGT原则

（1）由于胚胎基因诊断技术仍为有创检测，PGT原则上仅针对严重致畸、致残、致死性或者治疗费用极其昂贵的遗传性疾病，大部分SMA属于此类型遗传疾病，满足单基因遗传病PGT（PGT-M）的指征；

（2）基因突变携带者或先证者基因检测结果明确；

（3）夫妻双方对胚胎基因诊断的流程和风险充分了解，接受并出于主观愿望进行胚胎植入前基因诊断。

二、SMA-PGT适宜人群

（1）夫妻双方均为SMA基因突变携带者；

（2）夫妻中有一方或双方血液基因组SMN1未见异常，如仅有一次SMA患儿生育或妊娠史，首先推荐产前诊断；

如有2次及以上SMA患儿生育史或妊娠史，不排除生殖腺嵌合或一方为SMN1[2+0]基因型的可能性，这种情况符合PGT指征；

（3）由于基因和突变类型的特殊性，携带SMN1基因突变的遗传家系进行PGT，需提供试验所需的完整核心家系成员的样本（血液、组织或者DNA等）；

（4）夫妻双方无不适宜实施辅助生殖术的禁忌症。

三、PGT的目标基因及SMN1突变基因型

1．PGT检测的目标基因为SMA的致病基因SMN1，SMN2不在检测范围。

2．PGT技术目前大多采用碱基位点（SMN1和SMN2外显子7差异位点或微小变异位点）直接检测联合家系连锁分析的检测策略，这种策略在必需家系成员样本满足要求的条件下，理论上对SMN1突变类型并无特殊限制。

缺失型突变选择SMN1与SMN2在外显子7上的差异位点c.840C/T作为检测目标，以区分SMN1纯合缺失和非纯合缺失。

对于SMN1致病性微小变异的检测，由于SMN2的干扰，应用PCR技术直接检测