生物科技行业质粒DNA的提取与鉴定Word文件下载.docx

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50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。

高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。

溶液Ⅱ：

0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS（从10%SDS母液中稀释，SDS母液可室温保存），现配现用。

溶液Ⅲ：

5mol/LKAc60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL，高压灭菌，4℃冰箱保存。

溶液终浓度为:

K+3mol/L,Acˉ5mol/L。

3mol/L醋酸钠（pH5.2）：

800mL水中溶解408.1gNaAc·

3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100mL，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。

STE缓冲液：

0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·

Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。

TE缓冲液：

10mmo/LTris·

Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。

高压灭菌后储存于4℃冰箱中。

3、实验步骤讲解：

6分钟

将含有质粒pGFPuv的DH5α菌种划线接种在LB固体培养基（含有100μg/mLAmp）上，37℃培养12-24小时。

用无菌牙签挑取单菌落接种到5mLLB液体培养基（含有100μg/mLAmp）中，37℃振荡培养14~16小时。

取1.5mL培养液加入1.5mL离心管中，室温12,000r/min离心1分钟。

加入500μLSTE，涡旋打匀，室温12,000r/min离心1分钟。

弃上清，将管倒置于纸巾，使液体流尽。

加入100μL溶液Ⅰ重悬菌体，涡旋振荡，冰浴5分钟。

加入新配制的溶液Ⅱ200μL，盖紧管口，快速轻柔颠倒5次，至溶液澄清（千万不要振荡），冰浴5分钟。

加入150μL预冷的溶液Ⅲ，盖紧，管口朝下，轻柔振荡5~10次，冰浴5~10分钟，12,000r/min离心10分钟。

取上清移入干净Eppendorf管中，加入等体积的酚:

氯仿:

异戊醇（25:

24:

1），剧烈振荡20秒。

室温下12,000r/min离心5分钟，可见溶液分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为蛋白层，下层为有机相。

取上清，加入400μL氯仿:

异戊醇（24:

12,000r/min离心5分钟。

加入1/10体积3MNaAc，2倍体积无水乙醇，4℃沉淀10分钟或室温沉淀20分钟。

12,000rpm离心10分钟。

去上清，加入1mL75%乙醇，洗涤沉淀以去盐。

去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。

将沉淀溶于30μLTE缓冲液（pH8.0，含20μg/mLRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。

如直接酶切，可将沉淀溶于30~50μLddH2O（含20μg/mLRNaseA）。

利用比色法测定质粒DNA在260nm和280nm下的光吸收值并计算样品浓度。

用1%琼脂糖凝胶电泳观察质粒DNA的纯度和条带。

教学重点及难点：

1、碱变性法提取质粒DNA的原理。

教学方法：

采用启发式教学，结合理论，对实验步骤进行分析并给于适当示范。

教学手段（挂图、幻灯、多媒体…等）：

板书，PPT。

使用的教材及参考资料：

1、《现代生物学实验》，熊大胜主编，中南大学出版社， 

2005

2、《分子生物学实验指导》，魏群主编，高等教育出版社，2006

3、《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克等著金冬雁、黎孟枫等译

科学出版社1999

思考题：

1、碱法提取质粒过程中，EDTA、溶菌酶、NaOH、SDS、乙酸钾、酚/氯仿等试剂的作用是什么?

2、质粒提取过程中，应注意哪些操作，为什么?

3、用碱裂解法提取的质粒DNA通常都污染有细菌RNA分子，你采用什么策略能够去除RNA污染？

4、如果你提取的质粒DNA污染有少量的染色体DNA，那么你在操作过程中哪几步最可能出现了问题？

5、你提取的质粒DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中表现出几条带？

能否利用你所学习的知识解释这种现象？

本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在的问题、改进措施等）

1、结合理论内容讲述实验内容，采用开放性实验教学，效果较好。

2、强调实验操作规范，让学生养成良好的实验习惯。

实验21RNA的提取及鉴定

RNA的提取及鉴定（6学时）

1、学习和掌握提取总RNA的原理和方法；

2、学习和掌握总RNA浓度测定、质量及纯度的鉴定方法；

3、熟悉并掌握琼脂糖凝胶电泳技术与紫外分光光度计的使用方法。

4、采用开放性实验教学。

12分钟

总RNA的提取

真核细胞质总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA（10-15%）、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。

完整RNA的提取和纯化，是进行RNA方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。

所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即１）样品细胞或组织的有效破碎；

２）有效地使核蛋白复合体变性；

３）对内源RNA酶的有效抑制；

４）有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；

5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。

但其中最关键的是抑制RNA酶活性。

RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径，1）提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；

2）直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相，而RNA留在水相。

紫外分光光度法测定总RNA浓度及纯度鉴定

核酸分子中的碱基含有共轭双键，具有一定的紫外吸收特性，其最大吸收峰的波长为260nm。

另外，核酸分子在双链向单链形式转化过程中，紫外吸收增加，故单链DNA及RNA分子较双链DNA分子具有更高的紫外吸收能力。

这些物理特性为测定核酸样品浓度提供了基础。

在波长为260nm，光程为1cm，A260＝1时，相当于双链DNA浓度为50μg/mL，单链DNA或RNA为40μg/mL，单链核苷酸为20μg/mL。

紫外分光光度法可用于测定浓度大于0.25μg/mL的核酸浓度。

分光光度法不但能测定核酸浓度，还可通过测定在260nm和280nm的紫外吸收比值（A260/A280）估计核酸的纯度。

纯净的DNA样品的A260/A280为1.8，纯净的RNA制品的A260/A280为2.0。

DNA样品中存在将导致比值升高，而比值降低表明有蛋白质或苯酚等污染。

RNA浓度计算公式：

C（μg/mL）＝40μg/mL×

1/光程×

A260×

稀释倍数

琼脂糖凝胶电泳技术检测总RNA浓度和质量

琼脂糖英文名agarose，是由经过挑选、质地较纯的琼脂（agar）作原料制成的。

琼脂化学结构上是由琼脂糖和琼脂胶（agaropectin）组成的复合物。

琼脂胶是一种含有磷酸根和羟基的多糖，它具有离子交换性质，这种性质将给电泳及凝胶过滤以不良影响。

琼脂糖是一种直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成。

琼脂糖和琼脂一样也能形成凝胶。

形成凝胶主要是由于氢键的缘故。

由于琼脂糖具有亲水性及不含带电荷的基团，因此很少引起敏感的生物化学物质的变性和吸附。

琼脂糖凝胶电泳是实验室中最早得到广泛应用的凝胶电泳，是分离鉴定核酸的常规方法。

因为它具有以下优点：

1）琼脂糖凝胶中含有琼脂1.0%-1.5%，在这种凝胶中电泳，近似自由界面电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小；

2）琼脂糖凝胶电泳支持物均匀，电泳区带整齐，分辨率高，重复性好；

3）液相与固相界面无明显界限，电泳速度快；

4）琼脂糖凝胶透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定；

5）区带易染色，样品易回收。

核酸分子在高于其等电点的电泳缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动。

分子大小不同的核酸分子具有各异的电泳迁移率，而在电泳后处于凝胶的不同位置。

影响其电泳迁移率的因素包括电荷效应和分子筛效应。

前者由分子所带的净电荷多少而定，这与电泳时电流强度、电泳缓冲液的pH值和离子强度有关；

而后者主要与核酸分子大小和其构象以及所用琼脂糖凝胶的浓度有关。

2、实验试剂与器材2分钟

液氮罐、陶瓷研钵、冷冻高速离心机、恒温水浴器、恒温培养箱、高压灭菌锅、紫外线透射仪、吸头、乳胶手套、紫外分光光度计、电泳仪、水平式电泳槽、微波炉、Eppendorf微量离心管、微量加样器（pipetman）、三角烧瓶、烧杯、量筒。

总RNA提取试剂盒（TRIzolTM试剂）、0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）、75%乙醇、氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、10mg/mlEB溶液、5×

TBE电泳缓冲液（0.45mol/LTris、0.01mol/LEDTANa2、0.45mol/L硼酸，pH8.0）、溴酚蓝指示剂（0.25%溴酚蓝、50%甘油）、DNAmarker。

5分钟

组织总RNA的提取

把液氮冻存的组织放到冰冻的碾钵中碾碎，加入适量的Trizol试剂（1mL/100mg组织）裂解组织，冰上放置5min。

吸入1.5mL离心管中，加入氯仿（0.2mL/mLTrizol），冰上放置5min。

10000×

g离心10min，吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置10min。

g离心15min，去上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理的双蒸水（15-20μL）溶解。

4、总结2分钟

1、 

如何获得高质量的总RNA。

启发式教学，结合理论，对实验步骤进行分析并给于适当示范。

1、比较核酸浓度测定的几种方法。

2、在RNA提取过程中应该注意事项？

实验22半定量RT-PCR检测基因的表达差异（设计、创新）

半定量RT-PCR检测基因的表达差异（设计、创新）（9学时）

1、培养学生的创新意识和创新能力。

2、在任课教师的指导下，查阅资料，选题，开题，实施实验，最后以小论文的形式总结实验。

3、学习基因特异性引物的设计。

4、学习和掌握RT-PCR的原理和方法。

5、学习和掌握用半定量RT-PCR对基因表达水平进行相对定量的原理和方法。

6、采用开放性实验教学。

1、实验讲解：

查阅资料及选题10分钟

拟定实验提纲2分钟

准备实验2分钟

实施实验10分钟

以组织或细胞总RNA中的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，以Oligo（dT）或特异的下游引物合成与mRNA互补的cDNA片段。

所有合成cDNA的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应。

目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒（MLV）反转录酶。

AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。

cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3'

端poly（A）结合的12-18核苷酸长的oligo（dT）。

基因表达调控研究及其它研究中，常需要对基因表达的水平进行定量比较，因此在RT－PCR技术的基础上又发展了定量PCR。

这种方法需要选择一个合适的内对照。

由于PCR是一指数扩增过程，逆转录及扩增效率的很小差异就会导致扩增产物量的较大差异，以致定量不准确。

影响逆转录的因素有核苷酸序列的差异、ploy（A）尾的长度、PCR引物与poly（A）尾之间的距离等。

影响PCR扩增效率的因素有模板、引物、dNTP、MgCl2、DNA聚合酶以及循环次数等，这些参数较易控制，另外还有引物结合效率的问题，不同的引物具有不同的结合效率，它们可相差105倍，因此，进行定量PCR时要选用同一引物。

实验报告的写作2分钟

2、实验试剂与器材2分钟

3、总结2分钟

1、如何选择需要检测的目的基因。

2、目的基因特异性引物的设计。

3、基因表达差异的分析。

1、半定量RT-PCR对基因表达水平进行相对定量的原理和方法

1、结合理论内容讲述实验内容，采用开放性实验教学，效果较好。

2、采用开放性实验教学。

实验23大肠杆菌感受态细胞制备

大肠杆菌感受态细胞制备（3学时）

1、掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。

10分钟

转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，得了外源DNA的细胞称为转化子。

质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。

在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在选择培养基上长出转化子的过程。

质粒必须通过转化，才能进入细菌内进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因或其表达产物。

转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。

当细菌处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），其吸收外源DNA的能力最高，处于这种状态的细胞被称为感受态细胞（competentcell）。

用一定浓度的CaCl2处理此一时期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力,对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。

感受态细胞，用一定浓度的CaCl2处理此一时期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力，对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。

4、总结。

2分钟

CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。

1、制备感受态细胞时，应特别注意哪些环节？

1、采用开放性实验教学，效果较好。

2、学生实验结合理论内容进行自行设计，讲述实验设计方法，效果较好。

3、学生自己设计实验方案，培养学生分析和解决实际问题的能力，提高学生的主动性和创造性，得到能力的培养。

实验24目的基因的克隆与鉴定

目的基因的克隆与鉴定（12学时）

1、学习和掌握细菌转化与目的基因DNA分子增殖及其鉴定的原理和方法。

11、实验原理讲解：

转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，得了外源DNA的细胞称为转化子

感受态细胞

基因克隆

阳性克隆的鉴定

用碱裂解法提取质粒DNA

PCR产物的检测与回收

质粒DNA与目的基因DNA分子的连接

获得转化的感受态细胞

已转化的感受态细胞涂板培养，观察并鉴定

阳性克隆目的基因DNA分子的鉴定

2分钟

1、已转化的感受态细胞涂板培养，观察

2、阳性克隆目的基因DNA分子的鉴定

3、《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克等著金冬雁、黎孟枫等译，科学出版社1999

1、转化效率的计算。

2、阳性克隆鉴定的方法有哪些？

2、强调实验基本操作规范，让学生养成良好的实验习惯，具有扎实的实验技能。