整理培养基有效期的验证方案2Word下载.docx

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沙门氏菌Salmonellatyphimurium[ATCC14028]

铜绿假单孢菌Pseudomonasaeruginosa[ATCC9027]

枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis[ATCC6633]

生孢梭菌Clostridiumsporogenes[ATCC19404]

白色念珠菌Candidaalbicans[ATCC10231]

黑曲霉Aspergillusniger[ATCC16404]

3.4菌悬液的制备：

3.4.1各取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌斜面培养物一支，无菌操作接种一白金耳至TSB管中，30-35℃培养24-48小时，其中生孢梭菌需厌氧培养，取出置2－8℃贮存使用7天，每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约为10－100cfu/ml。

3.4.2取白色念珠菌斜面培养物一支，无菌操作接种一白金耳至TSB管中，20-25℃培养48-72小时，取出置2－8℃贮存使用7天。

取黑曲霉菌SDA斜面培养物用灭菌生理盐水洗脱孢子，置2－8℃贮存使用7天。

每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约10－100cfu/ml。

3.4.3菌悬液计数

3.4.3.1无菌操作吸取菌悬液1ml，加入含灭菌稀释剂100ml的三角瓶中，摇匀成10-2稀释液，同样操作制备10-4和10-6稀释液（必要时也可作更大倍数稀释）。

3.4.3.2每种菌悬液备好二只灭菌双碟和融化好并放至50℃的NA培养基和RNA培养基TSA培养基和SDA培养基。

3.4.3.3向双碟内注入10-6稀释液（必要时可以是其它浓度稀释液）1ml。

3.4.3.4向含稀释液的双碟内加入备好的培养基约20ml，迅速振摇混合稀释液和培养基，并放置使凝固成平板，其中生孢梭菌置于厌养袋中。

3.4.3.5翻转双碟置适宜温度培养（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌30-35℃培养24-48小时，白色念珠菌和黑曲霉菌20-25℃分别培养2-3天和3-5天）。

3.4.3.6计数平板上的菌落数求出平均值，得到稀释液的菌浓度要求应为含菌10-100cfu/ml，若不在此范围内可以改变稀释倍数，得到含菌符合要求的稀释液。

3.5实验步骤

3.5.1培养基的制备

3.5.1.1硫乙醇酸盐流体培养基（TGB）

酪胨（胰酶水解）15.0g

葡萄糖5.0g

L-胱氨酸0.5g

硫乙醇酸钠0.5g

或硫乙醇酸0.3ml

新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml

酵母浸出粉5.0g

氯化钠2.5g

琼脂0.7g

纯化水1000ml

用1N氢氧化钠或1N盐酸调节pH值，使灭菌后为7.1±

0.2，分装成100ml/瓶，按试剂标签说明要求121℃高压灭菌15分钟，备用。

使用前，培养基氧化层的颜色（粉红色）不得超过培养基深度的1/5。

否则，须经100︒C水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

3.5.1.2大豆酪蛋白消化肉汤培养基（TSB）

胰酪胨15.0g

大豆胨5.0g

氯化钠5.0g

纯化水1000ml

用1N氢氧化钠或1N盐酸调节pH值，使其灭菌后pH7.3±

0.2,分装成100ml/瓶，按试剂标签说明要求121℃高压灭菌15分钟，备用。

3.5.1.3营养琼脂培养基（NA）

胨

5.0g

肉浸出粉

3.0g

琼脂

12.0g

纯化水

1000ml

根据配制总量，称取干粉适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，加热煮沸至完全溶解，用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH值，使其灭菌后pH为7.0±

0.2，置121℃高压灭菌15分钟，备用。

3.5.1.4萨布罗葡萄糖琼脂培养基：

（SDA）

葡萄糖

40.0g

胨（肉和酪蛋白）

10.0g

15.0g

纯化水

1000ml

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为5.6±

0.2，置121℃高压灭菌15分钟。

灭菌前加入氯霉素50mg/L。

灭菌后于2-25℃贮存。

3.5.1.5平板计数培养基：

（PCA）

胰酶消化酪蛋白

5.建设项目环境影响评价文件的重新报批和重新审核酵母膏

2.5g

4.建设项目环境影响评价文件的分级审批葡萄糖

三、安全预评价报告的基本内容1.0g

琼脂

15.0g

规划编制单位应当在报送审查的环境影响报告书中附具对公众意见采纳与不采纳情况及其理由的说明。

（五）安全预评价方法根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.0±

1）地方环境标准是对国家环境标准的补充和完善。

在执行上，地方环境标准优先于国家环境标准。

3.5.1.6远腾琼脂培养基：

（ENA）

蛋白胨

价值=支付意愿=市场价格×

消费量+消费者剩余10.0g

磷酸氢二钾

2.早期介入原则；

无水亚硫酸钠

3.3g

乳糖

10.0g

4.选择评价方法阿拉伯胶

0.3g

（6）列出选定的评价方法，并作简单介绍。

12.5g

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.1±

3.5.1.7硫酸月桂醇肉汤（LST）

胰蛋白

20.0g

乳糖

5.0g

氯化钠

硫酸月桂醇钠

0.1g

磷酸氢二钾

磷酸二氢钾

1.0g

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为6.8±

0.2，加热煮沸1min，置121℃高压灭菌15分钟。

灭菌后于2-25℃贮存。

3.5.1.8亮绿乳糖肉汤培养基（BGLBB）

干牛胆

亮绿

0.0133g

3.5.1.9麦康凯琼脂培养基（Mac.A）

胰酶消化明胶

17.0g

胆盐混合物

1.5g

13.5g

中性红

30mg

结晶紫

1.0mg

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，加热煮沸1min，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.1±

3.5.1.10大豆酪蛋白消化琼脂培养基：

（TSA）

番木瓜酶消化大豆

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,加热煮沸至完全溶解,冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使其灭菌后pH7.3±

3.5.1.11假单胞菌分离琼脂培养基（PIA）

20.0g

氯化镁

1.4g

硫酸钾

氯苯酚

0.025g

13.6g

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.0±

0.2，置121℃高压灭菌15分钟。

3.5.1.12绿脓荧光素测定用培养基（PAF）

动物组织胃蛋白消化酶

无水磷酸二氢钾

硫酸镁（MgSO3.6H2O）

甘油

10.0ml

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,在振摇下加热煮沸1分钟，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使在灭菌后为7.2±

0.2。

置121℃高压灭菌15分钟。

3.5.1.13绿脓菌素测定用培养基（PAP）

胰酶消化明胶

无水氯化镁

3.5.1.14甘露醇胆盐琼脂培养基（MSA）

牛肉膏

1.0g

D-甘露醇

75.0g

酚红

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,在振摇下加热煮沸1分钟，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使在灭菌后的为7.4±

3.5.1.15溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（CET）

西曲溴铵

3.5.1.16沙门氏菌增菌培养基（RVSB）

大豆酪蛋白

4.5g

水合氯化镁

29.0g

8.0g

0.4g

0.6g

孔雀绿

0.036g

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,加热煮沸至完全溶解,冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使在加热后pH为5.2±

0.2，在灭菌锅中于115℃加热灭菌15分钟并立即冷却，灭菌后于2-25℃贮存。

3.5.1.17木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）

木糖

3.5g

L-赖氨酸

乳糖

7.5g

蔗糖

酵母膏

酚红

80mg

脱氧胆酸钠

硫代硫酸钠

6.8g

枸橼酸铁（III）铵

800mg

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,加热煮沸至完全溶解,冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使在加热后pH为7.4±

0.2，加热至刚沸，冷却至50℃并倒入陪替氏培养皿中，勿在灭菌锅中加热。

3.5.1.18麦康凯肉汤培养基（Mac.B）

乳糖水合物

胆汁

溴甲酚紫

10.0mg

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,加热煮沸至完全溶解,冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.3±

3.5.1.19曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）

曙红Y

2.0g

400mg

亚甲基蓝

65mg

0.2，在振摇下加热煮沸1分钟，然后置121℃高压灭菌15分钟。

3.5.1.20三糖铁琼脂（TSI）

动物组织胰酶消化物

乳糖

硫酸铁（III）铵

200mg

13.0g

25mg

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使在灭菌后的7.3±

在振摇下加热煮沸1分钟。

分装在试管中，置121℃高压灭菌15分钟，使凝固成斜面。

3.5.1.21萨布罗葡萄糖肉汤培养基（SDB）

胨（肉和酪蛋白）（1:

1）

3.5.1.22梭菌增菌培养基（RCM）

牛肉浸出粉

蛋白胨

酵母浸出粉

可溶性淀粉

D-葡萄糖-水合物

盐酸半胱氨酸

0.5g

醋酸钠

0.2，加热煮沸1min,置121℃高压灭菌15分钟。

3.5.1.23哥伦比亚琼脂培养基（CA）

胰酪蛋白胨

动物蛋白酶消化物

胰酶消化物

3.0g

酵母浸出粉

玉米淀粉

14.0g

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.3±

0.2，加热煮沸1min，置121℃高压灭菌15分钟，使用前冷至45~50℃，加入含20mg的无菌庆大霉素，混合摇匀，倾注平板。

3.5.1.24肠肝菌增菌培养基（EEB-M）

水合乳糖

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使在灭菌后为7.2±

0.2，100℃加热灭菌30分钟或121℃高压灭菌5分钟并立即冷却。

3.5.1.25紫红胆汁葡萄糖培养基（VRBGA）

7.0g

胆汁盐

水合葡萄糖

30mg

2mg

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使在加热后pH为7.4±

0.2，加热至刚沸。

勿再加热灭菌，于2-25℃贮存。

3.5.1.25取出所需配制的干粉培养基,检查干粉培养基是否处于有效期内。

根据配制需求量,按干粉培养基包装瓶上的配方准确称取所需的干粉培养基,并做好相应的《干粉培养基配制记录》（FARD-QC-304）及《灭菌原始记录》（FARD-211-037），见附件1。

3.5.2培养基的无菌性检查

3.5.2.1按照《微生物试验用培养基适用性检查操作程序》（FASOP-QC-032-7）“4.5培养基灭菌性检查”。

3.5.2.2填写《配制的培养基无菌检查记录》，见附件1。

3.5.4培养基的PH测定

用pH计测定培养基pH值，pH计的使用见《FE20型实验室pH计操作程序》（FASOP-QC-1136）见附件2，填写《培养基pH值记录》见附件1。

3.5.4培养基的营养性检查

3.5.4.1按照《微生物试验用培养基适用性检查操作程序》（FASOP-QC-032-7）“4.6.3促生长试验”见附件2。

3.5.4.2填写《培养基促生长试验原始记录》（FARD-QC-034），见附件1。

3.5.4将配制好经过无菌性检查和营养性检查合格后的培养基置于2-25︒C恒温环境中存放，每间隔一个月取相应的培养基进行培养基pH测定、无菌性检查和营养性检查（按步骤“3.5.2”、“3.5.3”和3.5.4进行操作），需验证的培养基每间隔一个月的检测结果如符合3.6结果要求，则继续放置在要求温度的恒温环境中，放置至第4个月。

3.6实验结果

3.6.1无菌检查结果均应澄清或无菌落生长。

3.6.2pH值应在灭菌后各培养基要求的pH值范围内。

3.6.3培养基营养性检查的结果

3.6.3.1按照《微生物试验用培养基适用性检查操作程序》（FASOP-QC-032-7）‘‘4.7结果判断”

3.6.3.2若培养基至第4个月经无菌性检查和营养性检查均符合要求则培养基的有效期定为3个月；

若培养基经无菌性检查和营养性检查有任何一项不符合要求则规定培养基有效期的不得超过该次存放时间前一次检测间隔的时间（例如，培养基在第3个月检测结果不符合要求，则培养基的有效期不得超过2个月）。

3.7本方案实施前应对参与本验证的人员进行培训。

4.参考文献

4.1中国药典.二部附录

H无菌检查法、

J微生物限度检查法.国家药典委员会.

4.2ICH.ProtocolTemplateQualificationoftheUSP/Ph.Eur./JPMicrobiologicalExaminationTestsforNon-sterileDrugProducts,DrugSubstancesandExcipients（Version1,Version2）.2007.

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